阴道炎是女性常见的生殖系统疾病，引起感染的常见病原菌为细菌、酵母菌和毛滴虫。毛滴虫是一种常见的性传播厌氧性寄生物。感染毛滴虫的女性可能通过相同途径感染其他性传播疾病，其中人乳头瘤病毒（ＨＰＶ）与宫颈癌前病变及宫颈癌的发生密切相关。ＨＰＶ病毒家族有１００多种基因型，其中１５种高危型具有很强的致癌作用［１－３］。本研究分析了感染毛滴虫女性的ＨＰＶ感染的频率及基因型分布情况。
１资料与方法
１．１一般资料
２０１０年１月至２０１４年１２月武汉市中心医院收治的滴虫感染，且同时做了ＨＰＶ检查的女性患者６７３例。
１．２仪器与试剂
ＨＰＶ分型检测试剂盒、ＤＮＡ提取试剂盒和ＤＮＡ扩增试剂盒及ＨＢ２００９Ａ快速杂交仪购自潮州凯普生物化学有限公司；ＣＦＸ９６伯乐公司ＰＣＲ仪。
１．３标本采集
采用阴道扩张器充分暴露宫颈，用棉拭子插入宫颈内１～２ｃｍ，停留１５ｓ，旋转２周，取得的阴道分泌物放入无菌试管中立即送检，采用直接涂片显微镜检查。然后拭去宫颈口过多的分泌物，将采样宫颈刷置于宫颈口，将宫颈刷旋转４～５圈，然后取出，折断刷头并放入洗脱管中，旋紧管盖并标记，置－２０℃冰箱保存待检。
１．４检测方法
１．４．１ＤＮＡ的提取取保存有宫颈细胞的细胞保存液０．５ｍＬ，以１４０００ｒ／ｍｉｎ离心１ｍｉｎ，弃上清后，采用潮州凯普生物化学有限公司的细胞裂解液提取ＤＮＡ，具体操作按照厂家说明书操作。１．４．２ＰＣＲ扩增将ＰＣＲＭｉｘ２３．２５μＬ，ＤＮＡＴａｑ酶０．７５μＬ，上述提取的ＤＮＡ１μＬ混匀。扩增反应体系为２５μＬ。同时设立空白对照，阳性对照。扩增条件为：９５℃预变性９ｍｉｎ；９５℃变性２０ｓ，５５℃退火３０ｓ，７２℃延伸３０ｓ，共４０个循环；７２℃保存５ｍｉｎ。１．４．３杂交、孵育和显色打开杂交仪，使其处于准备状态。取ＰＣＲ产物２５μＬ在９５℃加热５ｍｉｎ，然后立即冰水浴３ｍｉｎ。将上面变性好的ＰＣＲ产物加入０．５ｍＬ预热至４５℃的杂交液中，然后加在薄膜上，盖上盖板温育１０ｍｉｎ后，开泵进行导流杂交。杂交后用４５℃的杂交液冲洗膜三次，每次０．８ｍＬ。然后在２５℃用０．５ｍＬ封阻液封闭５ｍｉｎ。排干封阻液，加入０．５ｍＬ酶标液孵育５ｍｉｎ。用溶液Ａ洗膜４次，每次０．８ｍＬ。加入０．５ｍＬ的ＮＢＴ／ＢＣＩＰ溶液，显色５ｍｉｎ。完后排干ＮＢＴ／ＢＣＩＰ溶液，用溶液Ｂ洗膜３次，每次１ｍＬ，再用２ｍＬ的蒸馏水漂洗。晾干待读取结果。１．４．３结果判读（１）检测结果阳性点位清晰可见的蓝色圆点，Ｂｉｏｔｉｎ对照点和内对照点（模板ＤＮＡ探针）均为阳性结果有效。（２）空白对照为上面２个对照点阳性外，其他点全是阴性。（３）阳性对照为除２个对照点阳性，每个ＨＰＶ基因型对应的位置全是阳性。（４）每张膜上有２１种基因型：６、１１、１６、１８、３１、３３、３５、３９、４２、４３、４４、４５、５１、５２、５３、５６、５８、５９、６６、６８和８１。对应基因型位置出现清晰可见的蓝色圆点即为相应的基因型阳性。（５）如果有一个或者一个以上的基因型阳性，即代表ＨＰＶ该基因型阳性，结果为单一的或者混合的ＨＰＶ感染。１．５统计学处理采用ＳＰＳＳ１８．０统计软件进行数据处理及统计学分析。计数资料以例数或百分率表示，组间比较采用χ２检验，Ｐ＜０．０５为差异有统计学意义。
２结果
２．１不同年龄段滴虫感染患者的ＨＰＶ感染率
６７３例滴虫感染患者的ＨＰＶ总感染率为４２．２０％（２８４／６７３），４０～＜５０岁年龄段感染率最高，达４６．３６％（１２１／２６１），其次为大于或等于５０岁年龄段ＨＰＶ感染率４０．７８％（８４／２０６）、３０～＜４０岁年龄段３９．４３％（５６／１４２）和２０～＜３０岁年龄段３５．９３％（２３／６４）。但是不同年龄段ＨＰＶ感染率的差异无统计学意义（χ２＝３．４５０、Ｐ＝０．３２９）。
２．２不同年龄段患者
ＨＰＶ感染亚型的分布在２８４例滴虫、ＨＰＶ同时感染的女性中，ＨＰＶ高危型感染以１６型为主，其次是５２、５８、１８型等。低危型感染以１１型为主，其次为８１、６型等。除３０～＜４０岁年龄段高危型以５２型为主，其他三个年龄段与总体一致。５９、４２、４３型未检出。
３讨论
毛滴虫是一种常见的性传播寄生原虫，一般在２５～４２℃环境下能够运动，生长繁殖。感染的女性阴道分泌物呈黄色、稀水样或黏稠。直接涂片显微镜检查可以看到虫体活泼运动。通常通过不洁性生活传播，毛滴虫感染目前临床治疗效果较好。但是毛滴虫感染可增加其他性传播疾病的感染危险。在常见的性传播疾病中，ＨＰＶ的感染可以引起宫颈上皮细胞的瘤变和宫颈癌。多种ＨＰＶ基因亚型与宫颈癌的发生关系密切，ＨＰＶ病毒的筛查和分型对宫颈病变的预防、治疗和病理学检查都具有重要意义［４－７］。不同人群ＨＰＶ的感染率和基因亚型的分布有差异［８－９］。本研究特意选取６７３例发现滴虫并同时做了ＨＰＶ检测的受检女性进行分析，ＨＰＶ总感染率为４２．２０％（２８４／６７３）。滴虫阳性的女性ＨＰＶ总感染率与马杰等［１０］报道的武汉疑似ＨＰＶ感染女性检测阳性率４０．１７％接近，但是明显高于湖北宜昌地区报道的１４．７４％一般人群感染率［１１］，无锡市普通筛查女性１２．９８％的ＨＰＶ感染率［１２］，以及石家庄市接受ＨＰＶ筛查女性的３６．３％阳性率［１３］。武汉的报道受检对象是疑似人群，阳性率较高，其他地区针对普通女性，阳性率低。滴虫阳性的女性感染ＨＰＶ的概率高于普通女性。本研究４０～＜５０岁年龄段感染率最高４６．３６％（１２１／２６１），其次为大于或等于５０岁年龄段４０．７８（８４／２０６）、３０～＜４０岁年龄段３９．４３（５６／１４２）和２０～＜３０岁年龄段３５．９３（２３／６４）。与北京市报道的４０～＜５０岁年龄段感染率最高报道基本一致［１４］。与无锡市报道大于或等于５０岁年龄段检测阳性率最高［１２］，其次是４０～＜５０岁年龄段的报道稍有差异。湖北宜昌市的报道对年龄的分段与本文不同［１１］。但是本研究不同年龄段ＨＰＶ感染率的差异无统计学意义（Ｐ＞０．０５）。可能是滴虫感染特殊人群差异，也有可能是地域差异。在本文２８４例ＨＰＶ阳性的毛滴虫感染女性中，高危型感染以１６型为主，与湖北宜昌和马杰等［１０］人对武汉的报道一致。其次是５２、５８、１８型等。高危型的ＨＰＶ持续感染是宫颈癌的主要危险因素［１５］。低危型感染以１１型为主，其次为８１、６型等。除３０～＜４０岁年龄段高危型以５２型为主，其他三个年龄段与总体一致。无锡市的报道高危型以５２型为主，其次为１６、５８、６８、１８、３１型。除了最高危型不一致，基本相符。北京市的报道与本研究结果相似［１１］。低危型的检出一致，都是以１１型为主。不同地区高危型检出率分布基本一致，毛滴虫感染人群的ＨＰＶ感染型别没有明显差异。本文特意研究感染毛滴虫的女性的ＨＰＶ感染情况，发现该人群的ＨＰＶ阳性检出率高于一般人群筛查阳性率。但是该人群感染的ＨＰＶ高危和低危基因亚型没有改变。本文提示阴道分泌物常规检查发现滴虫的女性ＨＰＶ感染的阳性率较一般人群高，应尽早做ＨＰＶ筛查，预防宫颈癌的发生。
作者：孟少志 单位：武汉市中心医院
