1细胞总rNA的提取
收集到的各期细胞分别加500μLTrizol液充分裂解细胞，收集到无rNA酶的EP管中，加入100μL氯仿，室温静置3min，4℃12000r/min离心15min，吸取上清，加入等体积的异丙醇，剧烈震荡15s，室温静置10min，4℃12000r/min离心10min，弃上清，加入预冷75%乙醇800μL，4℃7500r/min离心5min，弃上清，干燥5min，加入无rNA酶水20μL，取1μLrNA，按照1∶50的比例稀释后用紫外分光光度仪检测A260和A280的值，对总的rNA浓度进行定量分析，余下的放－80℃保存。
2rT-PCr
收集同步化的各个周期时相的细胞，以不做任何处理HeLa细胞为对照，以GAPDH为内参，检测HeLa细胞中FAM92A1的表达。按照Promega逆转录试剂盒说明书操作，取1000ngrNA为模板，总体积为20μL，逆转录条件，70℃5min，42℃1h，95℃5min，－20℃保存;rT-PCr，将上述逆转录产物稀释10倍后取2μL为模板，反应总体积为25μL，反应条件为95℃2min预变性，95℃15s，55℃22s，72℃20s，72℃5min，36循环，用琼脂糖凝胶方法分析。
3结果
总rNA纯度外分光光度仪检测吸光度结果，G1期A260值为0.245，A260/A280比值为1.91;S期A260值为0.320，A260/A280比值为2.01;G2期A260值为0.224，A260/A280比值为1.95;M期A260值为0.106，A260/A280比值为1.96。电泳结果清晰显示5S、18S、28S三个条带，且18S和28S的灰度比为1∶2，表明所提rNA纯度很高，能够满足下一步实验要求。见图1。HeLa细胞同步化效率检测HeLa细胞各期同步化后，经流式细胞仪检测，G1期同步化效率为77.5%，S期同步化效率为85.5%，G2期同步化效率61.9%，M期同步化效率为44%。FAM92A1表达rT-PCr结果显示FAM92A1的表达随细胞周期时相的变化而存在差异，以S期表达量最高(如图2)。
4讨论
FAM92A1基因是近期发现的一个新基因，与细胞增殖关系密切，在正常生长旺盛的组织和肿瘤组织中高度表达，参与细胞周期调控［10］，但是其生物学功能目前尚不明确。细胞正常的分裂、增殖、分化与衰老维持着机体的稳定，细胞周期的异常会导致这一过程的紊乱。许多生长因子、细胞因子、激素及癌基因产物对DNA代谢的调节都是通过影响细胞周期实现的，许多基因的表达又受到细胞周期的制约。调控细胞周期的核心因子就是细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK，cyclindependentkinase)，它与不同的细胞周期蛋白形成多种复合物，作用于细胞周期的不同时相，决定着细胞周期的进程。而近几年来陆续发现的多种细胞周期蛋白依赖性激酶抑制蛋白(CKI，cyclindependentkinaseinhibitor)，更加深了对肿瘤发生机制的了解。基因突变或基因表达异常是肿瘤发生的关键。为了深入研究FAM92A1基因的生物学功能，本研究从细胞周期入手，首先通过细胞同步化方法，将细胞同步化于G1，S，G2，M期，运用流式细胞仪检测同步化效率，接着运用rT-PCr证实FAM92A1在HeLa细胞各个时相均有表达，以S期表达量最高，G1，G2，M期表达较低，这种各时相表达的差异性可能与FAM92A1在细胞周期中所起的调控作用关系密切。又知S期细胞的主要活动是进行DNA复制，DNA复制完成与否直接影响细胞增殖周期的运行，hFAM92A1基因过表达时发生S期阻滞，提示其与DNA复制有关。那么FAM92A1基因在其它肿瘤细胞各时相的表达及其具体的生物学功能又是怎么样的?有待机电论文范文于进一步工程管理论文的研究。
作者：方娟 王珺 龚坚 王燕 阮绪芝 单位：湖北医药学院 基础医学研究所
