1划痕试
于6孔板培养皿中常规培养细胞，6小时后待细胞贴壁生长后，200μL灭菌吸样枪头细胞划痕，在倒置显微镜下观察机械划并照相。48小时后，再次将培养皿在倒置显微镜，观察划痕并照相。每次照相在高倍镜下选取5个视野，同时使用测微尺测量划痕间隙的距离。于细胞操作台内将50μL200mg/L的Matrigel加入Transwell小室内，风干后置于细胞操作台内备用。使用前用RPMI1640培养液清洗，选择3孔，每孔分别加入100μL密度为2×106个/mL细胞悬液。将小室侵入24孔板含小牛血清1640培养基中，常规5%CO2、37°C培养箱内培养24h。取出Transwell小室，甲醇固定，龙胆紫染色及中性树脂封片。在光学显微镜下选择5个视野，计算透膜细胞总数。最后以透膜细胞的相对数来表示Tca8113细胞的侵袭能力。细胞活性检测：收获实验组及对照组的细胞，台盼蓝染色，细胞计数器计算出染色细胞，以此计算出细胞活性率。实验重复3次，取均数进行比较。统计学处理数据处理采用SPASS统计软件,计量指标采用均数±标准差（x軃±s）表示，差异性比较采用t检验和重复测量方差分析，P<0.05表示差异有统计学意义。
2结果
2.1、基因沉默结果鉴定
激光共聚焦显微镜下观察发现转染外源性质粒后细胞形态发生变化，细胞皱缩，细胞碎片增多。FAKsiRNA和NON-siRNA质粒因携带红色荧光标记和绿色荧光标记。成功转染后Tca-FAK组细胞中可见红色荧光表达，Tca-NON中可见绿色荧光表达，表明外源性质粒顺利转染入Tca8113细胞（图1a，b）。免疫细胞化学（图1c）及Western-blo（t图1e）结果显示：Tca8113细胞中FAK表达为强阳性，外源性质粒转染后Tca-FAK组FAK表达较转染前明显下降，Tca-NON组细胞中FAK表达无明显变化。表明RNAi成功实现FAK的下调（图1c，d，e）。
2.2、FAK基因沉默对舌癌细胞
Tca8113增殖和凋亡影响3组细胞在单层贴壁状态下培养16小时后，细胞活力检测及流式细胞仪结果显示：Tca-FAK及Tca-NON组细胞的活力较Tca8113组细胞有轻微的下降，凋亡片段也有轻微的增加，但各组间数据比较差异无统计学意义，表明FAK基因沉默对舌癌细胞的增殖和凋亡无明显影响。为了进一步观察FAK基因沉默对Tca8113失巢凋亡的影响，我们采用polyHEMA培养基剥夺细胞的贴壁培养条件，诱导细胞悬浮生长。不同于贴壁培养状态下细胞的单层生长方式，16小时后，显微镜下观察到，Tca8113细胞及Tca-NON组细胞呈现集聚性生长的方式（图2d，e），但Tca-FAK组细胞并未出现明显的集聚性生长状态（图2f）。流式细胞仪分析细胞凋亡结果显示：Tca-FAK的凋亡片段显著高于对照组及Tca8113组（P<0.01），表明FAK基因沉默可促进舌癌细胞的失巢凋亡（图2g）。2.3FAK基因沉默对舌癌细胞Tca8113迁移能力影响细胞化痕实验结果显示：48小时后对照组（Tca-NON）细胞迁移距离为（0.91+0.05）mm，实验组（Tca-FAK）细胞迁移距离为（0.30+0.03）mm，肿瘤细胞迁移能力明显降低（P<0.01），如图3。
2.3、FAK基因沉默对舌癌细胞
Tca8113侵袭能力影响体外Transwell小室实验结果显示：对照组细胞侵袭透膜数为211.4+5.3个，而FAK基因沉默后的Tca8113细胞，侵袭能力明显下降，仅为64.6+3.0（P<0.01）。见图4。
3讨论
为了验证FAK在舌癌侵袭转移中作用，初期体外实验中，课题组成功构建针对FAK的靶向RNA（smallinterferingRNA，siRNA）质粒表达载体，免疫细胞化学及western-blot蛋白印迹检测到舌癌细胞Tca8113中FAK表达明显下调。进一步实验，课题组通过划痕和Transwell小室侵袭试验来观察FAK基因沉默前后舌癌细胞侵袭和迁移能力的变化。实验结果显示FAK基因沉默后，Tca8113细胞的侵袭和迁移能力均得到明显抑制（P<0.01），初步显示FAK信号通路在舌癌细胞侵袭和迁移中的作用。锚着依赖性生存（anchor-dependentsurvival）是正常实体组织细胞具有的特点之一，一旦在脱黏附状态下就会发生凋亡，即失巢凋亡（anoikis）。发生转移的癌细胞则具失巢凋亡抗性，即在脱黏附状态下可以一种特殊的形式生存，这也是癌细胞可发生远处转移的生物学机制之一。目前已有学者通过体外实验证实失巢凋亡抗性在口腔癌、胰腺腺癌等的转移中起到关键性的作用[3-4，7-8]。为验证FAK信号通路在舌癌细胞增殖及凋亡中作用，本实验第一阶段在60mm培养皿上，将FAK基因干扰前后的细胞进行单层贴壁培养，细胞活性检测和流式细胞仪分析发现，基因干扰前后舌癌细胞Tca8113的活性及凋亡比较差异均无统计学意义。至于其中轻微的差异，笔者认为可能是基因片段转染入肿瘤细胞后，因负荷增加而导致其活性及凋亡有轻微差异。总结第一阶段实验结果，我们认为单层贴壁培养状态下，FAK信号通路改变对舌癌细胞的增殖和凋亡无明显影响。第二阶段，在相同条件下我们将基因沉默前后的细胞，在poly-HEMA处理过的60mm培养皿上进行相同时间的悬浮培养后，流式细胞仪测量的凋亡结果显示：悬浮培养状态下，FAK基因沉默后，细胞的凋亡率明显增加（P<0.01）。实验中我们有趣的发现，Tca8113细胞及Tca-NON组细胞呈现集聚性生长方式，但Tca-FAK组细胞并未出现这种集聚性生长。参考国内外文献，笔者认为FAK可能激活了包括MAPK、PI3K-Akt/PKB等信号级联反应，因失巢引起的源于细胞外基质的生存信号进而得到补偿。癌细胞因具有失巢生存的能力，可在脱黏附状态下生存，进而发生转移。综上所述，我们认为FAK基因沉默明显增加Tca8113细胞的失巢凋亡能力，进而a.FAK基因沉默明显抑制舌癌细胞Tca8113的迁移；b.数据分析显示，相同时间内（48h），FAK基因沉默后细胞（Tca-FAK）的迁移距离较对照组（Tca-NON）显著下调（P<0.01）。图3FAK基因沉默对舌癌细胞Tca8113迁移能力的影响a.FAK基因沉默明显抑制舌癌细胞Tca8113迁移；b.数据显示，48h相同时间内，FAK基因沉默后细胞（Tca-FAK）的迁移距离较对照组（Tca-NON）显著下调（P<0.01）。图4FAK基因沉默对舌癌细胞Tca8113侵袭能力影响治疗提供了契机，很可能成为当今肿瘤研究的工业经济期刊一个新热高效农业论文点。
作者：刘华联 江宏兵 承翼南 徐天舒 邢树忠 单位：常州市第一人民医院口腔科 江苏省口腔医院
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