1材料与方法
1.1细胞株和质粒载体
病毒包装细胞293T细胞及胃癌细胞系AGS购自ATCC。大肠杆菌DH5α购自上海吉凯基因公司，过表达慢病毒载体系统pGC-FU载体及ＲNA干扰慢病毒载体系统均购自上海吉凯基因公司，ＲNA干扰慢病毒载体系统包括pGCSIL-GFP载体、pHelper1.0载体和pHelper2.0载体。
1.2主要试剂
M-MLV逆转录酶、ＲnaseInhibitor、dNTPs为美国promega公司产品;SYBＲMasterMixture、DL2000DNAMarker、Taqpolymerase、各种内切酶、T4DNAligase、Taqpoly-merase等购自日本Takara公司;质粒提取试剂盒由德国QIAN-GEN公司生产;MTT试剂盒、细胞凋亡试剂盒(Annexin-V-FITC/PI)、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒为上海碧云天公司产品;BSA及台酚蓝由上海捷倍思基因技术有限公司生产;ECL-PLUS/Kit由美国Amersham公司产品;Lipofectamine2000、Tr-izol由美国Invitrogen公司产品;AxyPrePPlasmidMiniPrepKit、AxyprepPCＲCleanuPKit、AxyprepDNAGelExtractionKit、AxyPrepPlasmidMiniprepKit产生美国Axygen公司;胎牛血清、ＲPMI1640培养基、Opti-MEM、DMEM培养基购自美国GIBCO公司;抗p130Cas和抗p130Cas磷酸化抗体为英国Abcam公司生产;NC膜、ECL试剂盒由美国millpore公司提供。
1.3方法
1.3.1细胞培养和处理
AGS细胞常规培养于ＲPMI1640培养液含10%胎牛血清、链霉素(100μg/ml)和青霉素(100μg/ml)，于5%CO2、37℃的细胞培养箱中培养，隔天换液，3到4d传代。
1.3.2Ｒeal-timePCＲ检测胃癌细胞系p130Cas基因表达
Tr-izol法提取胃癌细胞SGC-7901，H1299，MKN45，AGS的总ＲNA，紫外分析测定所抽提ＲNA的浓度，ＲNA逆转录获得cD-NA，Ｒeal-timePCＲ法检测p130Cas基因表达。
1.3.3p130CassiＲNA慢病毒载体的构建
设计的siＲNA序列信息为:CCTTGCAGTACCCATCGCCTT。复苏并扩增DH5α菌种(含有pGCSIL-GFP质粒)，抽提pGCSIL-GFP质粒，以Eco-ＲI对质粒进行双酶切后回收酶切产物，利用T4DNA连接酶将线性化的pGCSIL-GFP载体和目的基因p130Cas在连接缓冲液中16℃过夜连接。以氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞，重组载体的转化感受态细胞。由上海吉凯基因公司对重组siＲNA-p130Cas慢病毒载体进行测序及比较。将重组慢病毒载体转染293T细胞后收获病毒并测定病毒滴度。
1.3.4p130Cas过表达慢病毒载体构建
设计合成如下引物:p130Cas(正义):5＇-gaattcatgcctgccaagcccttcct-3＇，p130Cas(反义):5＇-ggatcctcaggcggctgccagctggc-3＇复苏并扩增DH5α菌种(含有pGC-FU质粒)，抽提pGC-FU质粒，以AgeI和BamHI对质粒进行双酶切后回收酶切产物，连接后重组载体转化感受态细胞，同上步骤测序及进行病毒包装。
1.3.5重组慢病毒载体感染AGS细胞和获取稳定转染细胞株
取对数生长期的AGS细胞，按每孔2×105个细胞铺入24孔板，37℃细胞培养箱过夜，第2天细胞约为密度约50%。取包装好的慢病毒p130CassiＲNA载体，p130Cas过表达载体及相应的对照载体，置于冰上融化，除去AGS细胞的培养液，加入稀释混匀的病毒液，上下左右轻轻摇匀，37℃细胞培养箱培养8～12h，移除含病毒的培养液，更换含10%胎牛血清的1640培养液，继续培养2～3d，利用荧光显微镜观察绿色荧光表达情况结合流式分选获得稳定感染细胞株。
1.3.6逆转录PCＲ检测各转染细胞系p130Cas基因表达
抽提各转染细胞组的质粒进行PCＲ反应，循环参数为94℃预变性5min，94℃变性30s，56℃退火45s，72℃延伸1min，共25～35个循环，最后72℃延伸7min。取8μlPCＲ产物在琼脂糖凝胶上进行电泳，紫外光下自显影，经计算机扫描成像。
1.3.7细胞总蛋白提取
胰酶消化收集各转染组及对照组细胞，加入混有PMSF的ＲIPA细胞裂解液，于冰上利用超声仪超声裂解细胞，4℃，12000r/min离心5min，转移上清至新的EP管，采用Bradford法测定目的蛋白浓度。
1.3.8Western印迹检测各组细胞p130Cas蛋白水平
各组取80μg总蛋白量的样品液，聚丙烯酰胺凝胶电泳后经硝酸纤维素膜转移，将膜在含10%脱脂奶粉TBS中封闭2h后，与p130Cas单克隆抗体中4℃孵育过夜，洗涤后再与相应的二抗室温下作用1h，经ECL底物化学发光显影，扫描为图片，经ImageJ软件测量胶片中条带灰度值。
1.3.9Western印迹检测各组细胞p130Cas磷酸化水平
各组取80μg总蛋白量的样品液，电泳后转移至硝酸纤维素膜，封闭后与抗p130Cas磷酸化抗体4℃孵育过夜，洗涤后再与相应二抗室温下作用1h，发光显影后测量胶片中条带灰度值。
1.3.10四甲基偶氮唑蓝比色(MTT)实验检测各组细胞增殖能力
MTT粉溶解于PBS缓冲液配制成MTT工作液，浓度为5mg/ml，4℃避光保存。取对数生长期的稳定感染p130CassiＲNA和过表达p130Cas的AGS细胞及对照组细胞，胰酶消化重悬为单个细胞悬液，接种7块96孔板，每孔细胞数为2000个，每孔体积200μl，每孔设置4个复孔，培养3d后取出96孔板，每孔加入20μlMTT工作液溶液，二氧化碳孵育箱培养4h，吸去培养上清液，每孔加入DMSO150μl，振荡10min，将96孔板放入酶联免疫读数仪，595nm波长处，测定各孔的吸光度，其中设置只加培养液的孔作为空白对照孔，计算各组的平均吸光度(OD)值。
1.3.11流式细胞术检测各组细胞凋亡状况
采用AnnexinV-PI法检测细胞凋亡率。收集对数生长期的稳定感染p130CassiＲNA和过表达p130Cas的AGS细胞及对照组细胞于离心管中，每样本细胞数为(1～5)×106/ml，500～1000r/min离心5min，弃去培养液，孵育缓冲液洗涤1次，离心后用标记溶液重悬细胞，室温下避光孵育10～15min，离心5min后沉淀细胞用孵育缓冲液洗1次，加入荧光(SA-FLOUS)溶液4℃下孵育20min，流式细胞仪分析(流式细胞仪激发光波长用488nm，用一波长为515nm的通带滤器检测FITC荧光，另一波长大于560nm的滤器检测PI)。结果判断:在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象限显示活细胞，为(FITC－/PI－);右上象限是非活细胞，即坏死细胞，为(FITC+/PI+);而右下象限为凋亡细胞，显现(FITC+/PI－)。
1.4统计分析处理
使用SPSS17.0软件行t或χ2检验。
2结果
2.1p130Cas在各胃癌细胞系中的表达
为检测p130Cas是否在胃癌细胞株中普遍表达，首先在胃癌细胞系SGC-7901，H1299，MKN45，AGS中利用Ｒeal-timePCＲ检测p130Cas的表达情况，对照GAPDH和BCAＲ1基因表达引物采用软件Beacondesigner2设计。SGC-7901，H1299，MKN45，AGS细胞均高表达BCAＲ1/p130Cas基因表达丰度能满足检测实验要求，本实验选取AGS细胞为研究对象。
2.2p130CassiＲNA慢病毒载体的鉴定
2.2.1pGCSIL-GFP载体的酶切鉴定使用EcoＲI对pGCSIL-GFP载体进行酶切，酶切产物电泳检测结果。见图2。
2.2.2p130CassiＲNA慢病毒载体的测序鉴定设计的p130CassiＲNA慢病毒载体经上海吉凯公司测序鉴定，经验证siＲNA插入正确，siＲNA慢病毒载体构建成功。
2.3p130Cas过表达慢病毒载体的鉴定
2.3.1pGC-Fu载体的酶切鉴定使用AgeI和BamHI对pGC-Fu载体进行双酶切。酶切产物电泳检测结果。
2.3.2p130Cas过表达慢病毒载体的测序鉴定设计的p130Cas慢病毒载体经上海吉凯公司测序鉴定，经验证p130Cas插入正确，慢病毒过表达载体构建成功。
2.4PCＲ检测慢病毒载体转染后各组细胞p130Cas表达情况
p130Cas慢病毒过表达载体及慢病毒siＲNA载体分别感染胃癌AGS细胞，半定量PCＲ检测p130Cas表达结果提示转染慢病毒过表达组p130Cas表达明显增高，感染慢病毒siＲNA载体组p130Cas基因表达明显受到抑制。
2.5各细胞组中总p130Cas的表达情况及磷酸化水平检测
与对照组及空载体组相比，慢病毒过表达载体组p130Cas表达量明显增加(P＜0.05);而慢病毒siＲNA载体组p130Cas表达量与其对照组和空载体组比较显著下降(P＜0.05)。同时为了明确细胞体外的磷酸化水平，Western印迹法检测在未添加任何刺激物情况下的各组细胞p130Cas蛋白的磷酸化情况，结果发现，在未添加刺激物的情况下体外细胞AGS细胞、NCＲNAi组及NC过表达组即可检测到p130Cas磷酸化，三者两两之间无差异(P＞0.05);与对照组及空载体组相比，转染siＲNA载体组的胃癌细胞中p130Cas磷酸化水平下降(P＜0.05);而转染过表达载体组与对照组和空载体组相比，胃癌细胞中p130Cas磷酸化水平无变化(P＞0.05)。
2.6p130Cas的表达对AGS细胞体外增殖能力的影响
p130Cas过表达组与其对照组和空载体组间分别比较均无差异(0.353±0.075、0.374±0.045、0.401±0.026，P＞0.05);p130CassiＲNA组(0.233±0.055)与其对照(0.386±0.065)及空载体组间分别比较两者的差异显著(P＜0.05)。
2.7p130Cas的表达对AGS细胞凋亡的影响
与空载体组及NCＲNAi转染的AGS细胞相比，利用p130CassiＲNA载体下调p130Cas基因表达后，AGS细胞凋亡率增加，达到49.78%(P＜0.05);上调胃癌细胞株AGS细胞p130Cas基因表达后，AGS细胞凋亡与其对照组及空载体组相比较无差异(P＞0.05)。
3讨论
本研究结果提示p130Cas的表达可能在胃癌细胞生物学功能中发挥重大作用。在此基础之上本实验分别成功构建了p130Cas慢病毒干扰载体和过表达载体及相应的对照载体，在证实慢病毒载体构建成功之后，分别用上述病毒载体感染AGS细胞，筛选出稳定感染的细胞株。本研究提示阻断p130Cas表达和活化可以抑制胃癌细胞的增殖。阻断p130Cas可以促进胃癌细胞凋亡。本研究结果与既往研究并不矛盾，Cabodi等〔3〕通过动物实验发现，p130Cas过表达可促进乳腺上皮广泛增生，只有磷酸化的p130Cas才能激活小GTPasesＲas和Ｒac，使下游的JNK和Erk1/2-MAPK激活〔4〕，最后形成的AP-1转录激活子能够提高特定靶基因的转录水平进而调节细胞增殖〔5〕。本研究提示在体外未添加刺激物情况下胃癌细胞p130Cas即有多量磷酸化，属于过表达的分子，这可能与整合素活化、生长因子刺激、G蛋白耦联受体的肽激素配体、机械牵张等多种原因诱导p130Cas磷酸化有关，并导致p130Cas磷酸化程度在细胞中呈现饱和状态，这解释了MTT试验结果显示的p130Cas高表达组未能促进细胞增殖的原因。同样，目前大部农业经济期刊分研究证经济类国家级期刊实p130Cas有抗凋亡作用〔6〕。最近一项研究显示野生型p130Cas的过表达在凋亡中起保护细胞的作用〔7〕，而抑制p130Cas表达诱导细胞凋亡。Ta等〔8〕研究表明p130Cas过表达事实上对促凋亡刺激来说是个障碍。结合本研究结果证实胃癌p130Cas自身磷酸化水平呈现“过表达”的饱和状态，发挥着重要的抗凋亡作用。
作者：李丹 丁健 王锦坡 吴婷 王小众 单位：福建医科大学附属协和医院消化内科
