1统计学方法
所有数据以均数±标准差表示，采用SPSS13.0软件作统计处理，两样本均数比较采用成组设计资料t检验，多组之间的均数比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，细胞活力检测采用双因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1ERCC1基因在SKOV3细胞和SKOV3/DDP细胞中的表达RT-PCR检测结果显示：采用2-△CT法进行相对定量分析，以GAPDH为内参基因对上样量进行校正。使用t检验进行统计学分析，t=-9.856，P=0.01，SKOV3/DDP与SKOV3相比，差异有统计学意义，n=3（见图1）。Western印迹法检测结果显示：SKOV3／DDP细胞中ERCC1蛋白的相对表达量明显高于SKOV3（P<0.01），表明ERCC1在卵巢上皮癌DDP耐药细胞株SKOV3/DDP中的表达较亲本细胞株SKOV3明显升高（见图2）。
2.2ERCC1shRNA的筛选构建获得的3个克隆有ERCC1shRNA的重组质粒分别转染至SKOV3／DDP细胞，从而筛选获得稳定转染的细胞株，采用RFQ-PCR法检测ERCC1mRNA的表达，PLVX-ERCC1-shRNAC为对照。ERCC1mRNA的检测结果显示，与未转染组相比，PLVX-ERCC1-shRNA1转染组抑制ERCC1基因的的效果最明显，ERCC1基因相对表达量均值为0.24667，明显低于PLVX-ERCC1-shRNA2（0.836667）组和PLVX-ERCC1-shRNA3（0.412667）组，与PLVX-ERCC1-shRNAC相比，PLVX-ERCC1-shRNA1及PLVX-ERCC1-shRNA3差异均有统计学意义(P<0.01)；PLVX-ERCC1-shRNA2差异无统计学意义(P>0.05)。从结果可以看出PLVX-ERCC1-shRNA1对ERCC1干扰效果较好，shRNA1为基因最佳片段，因此后续实验选取PLVX-ERCC1-shRNA1进行研究（见图3）。
2.3ERCC1基因沉默后细胞中ERCC1蛋白的表达Western印迹法检测结果见图4。SKOV3、DDP-shRNAC细胞中ERCC1蛋白的相对表达量明显高于SKOV3／DDP-shRNA1，进一步证实本实验设计的shRNA能有效而特异地沉默ERCC1基因，抑制ERCC1蛋白的表达(P<0.01)。
2.4shRNA对SKOV3/DDP细胞ERCC1沉默DDP耐药性的影响细胞活力检测结果显示，不同剂量DDP处理ERCC1稳定沉默细胞株24h后，细胞活力显著低于其对照细胞，差异有统计学意义（P<0.05）。上述结果提示，特异性沉默ERCC1基因能增强SKOV3／DDP细胞对DDP的敏感性（见图5）。
3讨论
卵巢是女性盆腔深部器官，原发性卵巢上皮癌起病隐匿，发现多为晚期，是妇科恶性肿瘤中预后较差的肿瘤之一。目前认为有效的治疗方案是理想的初次肿瘤细胞减灭术(optimalprimarycytoreductivesurgery，OPCS，肿瘤残留病灶<1cm)及术后辅以铂类为基础的联合化疗。虽然普遍的以铂类为基础的初始联合化疗被认为有较高的有效性，但肿瘤细胞原发或继发的铂类耐药，严重影响了化疗疗效。化疗耐药已成为目前卵巢上皮癌患者预后差的重要原因之一，20％～30％的卵巢上皮癌患者表现为铂类原发耐药，最终有80％的患者出现继发耐药，多数患者会复发，并最终死于耐药性疾病［9-10］。随着生物及遗传技术研究的迅速发展，顺铂耐药被认为与NER密切相关。ERCC1基因是一种高度保守的单链DNA核酸内切酶，是一组DNA损伤的识别，切除蛋白，在修复过程中起关键作用，其正常表达是维持该修复酶功能的重要分子基础。研究显示，在DNA修复过程中，ERCC1通过与着色性干皮病因子F(XPF)形成ERCC1-XPF异二聚体而发挥作用，被认为是NER途径的关键基因［11-12］。若ERCC1低表达，机体核苷酸切除修复能力降低，细胞发生癌变的可能性将会增加；相反，若ERCC1过表达，则可使细胞停滞在G2／M期的DNA损伤迅速修复，从而降低肿瘤的发生［1］。ERCC1目前已经成为许多研究的焦点，目的在于发现肿瘤抵抗铂基础化疗的机制。Feng-Ying等［2］为评估ERCC1是否与卵巢上皮癌耐药有关，在Medline、Pubmed、Webofscience和CNKI数据中搜索关于ERCC1表达与卵巢上皮癌铂类化疗反应的文章，用固定效应Meta分析进行数据分析，产生有关ERCC1表达与卵巢上皮癌铂类化疗反应的混合优势比及95%可信区间，用Begg测试检验选择偏倚，卵巢上皮癌患者中ERCC1表达阴性的患者对铂类化疗敏感性较阳性表达者好，提示ERCC1的表达与铂类耐药显著相关［2］。赵丹等［3］研究ERCC1，BRCA1,β-tubulinⅢ和TUBB3mRNA的表达与卵巢上皮癌临床化疗敏感性的关系，提示ERCC1，BRCA1mRNA的表达与原发性卵巢上皮癌临床铂类化疗方案的敏感性呈负相关。但Mustafa等［4］研究卵巢上皮癌患者中ERCC1的基因表达与卵巢上皮癌一线化疗药物铂类的耐药性之间的可能联系，结果提示低、中、高ERCC1的表达与自由进展生存期无明显差异，在初始卵巢上皮癌患者中ERCC1的表达与铂耐药无显著相关性。因此，综合目前国内外相关文献表述，ERCC1与卵巢上皮癌铂类耐药之间的关系仍然存在争议。RNA干扰（RNAinterference,RNAi）是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA（double-strandedRNA，dsRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭某些特定选择基因的表达（长度超过30的dsRNA会引起干扰素毒性），所以目前这种技术被广泛用于研究基因功能、传染性疾病和恶性肿瘤［13］。但是化学合成siRNA转染细胞介导RNAi，由于抑制时间短、成本高、效果不稳定等缺点限制了其在生物医学方面的研究应用。为了弥补这些方面的局限，近年来迅速发展的shRNA表达载体可在生物体内被加工成siRNA，进而稳定且特异地导致目标基因沉默。与传统的基因沉默技术相比，shRNA表达载体具有稳定性好、效率高、可传递性强等优点，在恶性肿瘤的基因治疗上具有良好的应用前景［14］。
本研究采用RNA干扰技术有效沉默ERCC1基因，在细胞水平研究ERCC1与卵巢上皮癌细胞株SKOV3铂类耐药的关系，并研究ERCC1基因沉默后对细胞耐药性的影响。本研究结果显示：在卵巢上皮癌耐药株SKOV3／DDP中，ERCC1mRNA和蛋白的表达较其亲本SKOV3细胞明显增高，提示ERCC1基因过表达与卵巢上皮癌的DDP耐药存在相关性，ERCC1可能在卵巢上皮癌DDP耐药过程中发挥重要作用。为进一步证实ERCC1基因与卵巢上皮癌DDP耐药的关系，我们人工构建了靶向沉默ERCC1基因的重组慢病毒载体，并将其导入卵巢上皮癌DDP耐药细胞株SKOV3/DDP，研究小RNA干扰沉默ERCC1基因后对细胞ERCC1表达及DDP耐药的影响。RT-PCR及Western-blot结果显示，稳定沉默ERCC1后细胞中ERCC1的表达明显降低；CCK-8法结果显示，稳定沉默ERCC1的shRNA能使SKOV3/DDP细胞对DDP的敏感性增加，一定程度地逆转了SKOV3/DDP细胞的顺铂耐药性，以ERCC1基因为靶向小分子RNA干扰技术可有效地恢复SKOV3/DDP细胞对DDP的敏感性，提示ERCC1基因在卵巢上皮癌细胞DDP的耐药中起重要作用，为逆转卵巢上皮癌顺铂耐航空机电论文药治疗提工商管理论文供新的干涉靶点，为临床治疗提供了一条新的途径。
作者：杜培 王沂峰 张晓薇 陈礼全 淦亚萍
