摘要：玉米胚性愈伤组织的诱导率直接影响玉米遗传转化效率。本研究利用N6培养基诱导玉米幼胚产生胚性愈伤组织，以筛选玉米转基因受体材料。从215个玉米基因型中筛选出28个胚性愈伤组织诱导率较高的材料，其中，6个基因型的诱导率高于对照A188和Hi-II。基因型“吉V130”胚性愈伤组织诱导率最高，作为受体材料进行转基因研究中，获得了较高的转化效率。该基因型在今后玉米基因功能研究和基因工程育种中可作为重要的受体材料。
关键词：玉米基因型；胚性愈伤组织；转基因
我国是世界上第二大玉米生产国，玉米在我国经济生产中占有非常重要的地位。长期以来，科研工作者利用常规育种技术，即通过有性杂交实现基因重组，育成了大量优良品种。但是，利用常规杂交育种技术进行玉米改良中受到很多因素的影响，如优良亲本自交系当选率低，自交系的培育和改造困难，育种周期长，特别是由于栽培品种中某些特定种质资源的缺乏，以及远缘杂交不亲和性等障碍，限制了物种间优良性状的转移。随着生物技术的迅速发展，利用基因工程技术改良玉米常规育种难以改良的性状（如品质改良、抗虫、抗病、抗旱等）变得现实可行，并取得了传统育种技术难以达到的效果[1],目前，基因工程技术已经应用于玉米优良品种选育和遗传改良中，在某些研究方面获得了很大的进展，并进入产业化阶段[2]。建立稳定、简便和高效的遗传转化系统是玉米基因工程育种应用的前提条件，良好的受体材料是遗传转化成功的关键因素。科研工作者虽然通过优化各种影响因子建立了玉米遗传转化技术体系，但其转化效率仍然受玉米基因型的限制。目前为止，玉米转基因研究大都仍局限于A188和Hi-II等少数几个基因型作为受体材料[3-15]，虽然也有一些利用玉米主要自交系遗传转化研究报道[16-25]，但转基因成功的事例较少，主要原因是大多数生产上常用的自交系很难形成Ⅱ型愈伤组织，遗传转化技术体系尚未成熟，基因型依赖性强是影响转化的主要限制因素。随着玉米基因组学的迅速发展，高效遗传转化技术体系将成为玉米基础研究和品种改良的关键技术之一。本研究将依据不同玉米基因型胚性愈伤组织的诱导率，筛选农艺性状较好且适宜于遗传转化的转基因受体材料，为今后玉米转基因研究和基因工程育种提供更好的受体材料。
1材料与方法
1.1玉米材料
本研究共用“吉V130”等215个玉米基因型，均由吉林省农业科学院生物技术研究所保存，以A188和Hi-II为对照材料（表1列出的材料为部分胚性愈伤组织诱导率较好的自交系）。玉米自交系于2009年5月初种植于吉林省农业科学院（公主岭）试验地。
1.2诱导培养基
胚性愈伤组织诱导培养基为N6培养基[26]，附加100mg/L肌醇、2.76g/L脯氨酸、100mg/L水解酪蛋白、2mg/L2，4-D、30g/L蔗糖、3g/L植物凝胶，pH5.8，高压灭菌后加入硝酸银（4.3mg/L）。再生培养基：植株再生培养基为190-2培养基[27]，附加30g/L蔗糖、3mg/L6-BA、3g/L植物凝胶，pH5.8，高压灭菌。
1.3幼胚培养
于7月底取授粉后10～11d玉米幼穗（幼胚大小约为1～2mm），去除苞叶后，在超净工作台上用1%的氯化汞消毒15min，再用灭菌水洗涤3次。用解剖刀剥取幼胚，幼胚盾片朝上接种于诱导培养基上，每皿培养基接种20个幼胚（培养皿大小为直径100mm×高25mm），于27℃暗培养。
1.4继代与再生培养
胚性愈伤组织每隔2周进行继代培养（继代培养基同诱导培养基），每隔4周取部分胚性愈伤组织于再生培养基上进行植株再生，测试胚性愈伤组织的再生能力。
1.5数据统计
本试验采用完全随机试验设计，每皿培养基接种20个幼胚，约100个幼胚为一个重复，每个基因型共接种约500个幼胚。对不同基因型间胚性愈伤组织诱导率进行方差分析，并比较基因型间胚性愈伤组织诱导率差异显著性，利用DPS进行数据统计分析。
2结果与讨论
本研究共用了215个玉米基因型进行了试验，大部分基因型胚性愈伤组织诱导率较差或难以诱导胚性愈伤组织。有28个基因型胚性愈伤组织诱导率较高（>20%，表1）且愈伤组织为Ⅱ型胚性愈伤组织（松脆、生长快且再生能力强），基因型间胚性愈伤组织诱导率差异极显著（P<0.01），其中6个基因型的诱导率高于A188（72%）和Hi-II（73%）。“吉V130”的诱导率最高，为77.94%（表1，图1a、b），且愈伤组织为Ⅱ型愈伤组织。胚性愈伤组织经过14个月的继代培养仍保持较强的再生能力(图1c、d)，绿苗再生率为93%。在农杆菌介导的玉米遗传转化中，良好的受体系统是转化成功的关键因素。用于玉米转基因受体材料有多种，包括：原生质体、胚性愈伤组织、幼胚以及直接分生组织等。玉米幼胚是进行遗传转化常用的受体材料，已被广泛用于转基因研究中[3，5，9-10，12-13]。玉米受体材料必须具有较高的胚性愈伤组织诱导率和再生能力，才有可能获得较高的转化效率。而玉米基因型对胚性愈伤组织的诱导和植株再生起决定作用，是玉米转化效率的主要限制因素。本研究筛选出28个胚性愈伤组织诱导率较高的基因型，其中6个基因型的诱导率高于A188和Hi-II。这些材料不仅具有很好的胚性愈伤组织诱导率，而且具有较高的再生能力。本研究基因型“吉V130”胚性愈伤组织诱导率最高，经过长期继代培养的胚性愈伤组织仍保持很强的再生能力。本实验室后期选用“吉V130”幼胚作为受体材料进行遗传转化，获得了较高的转化效率。由于该基因型具有相对较好的农艺性状且转化效率高于A188和Hi-II，在今后的玉米转基因研究中，可作为重要的受体材料。玉米幼胚胚性愈伤组织的诱导主要受基因型、幼胚大小、植株的发育状态及培养条件等因素影响，其中基因型影响最大。玉米幼胚诱导的愈伤组织主要有3种类型，Ⅰ型为结构致密的块状组织；Ⅱ型为愈伤组织为结构松脆、生长快、颜色鲜亮的胚性愈伤组织，再生能力强；Ⅲ型为愈伤组织呈松软、水浸状，不具有再生能力。本研究不同基因型间胚性愈伤组织诱导率差异较大，变幅为0～78%，这表明了玉米基因型对胚性愈伤组织诱导率的显著影响，这与前人的研究结果相一致[28-30]。本试验中部分基因型胚性愈伤组织诱导率（如：农系531、7922、340、8902、Mo17等）与已报道的诱导率有一定的差异[29,31-34]，这可能是因为玉米材料的来源不同，遗传背景有一定的变异以及培养条件的差异造成的。
3结论
本研究利用玉米幼胚诱导胚性愈伤组织，根据胚性愈伤组织诱导率筛选出6个诱导率高于A188和Hi-II的玉米材料；基因型“吉V130”胚性愈伤组织诱导率最高，胚性愈伤组织经过长期继代培养后仍保持很强的再生能力。在后期作为受体材料进行转基因研究中，获得了较高的转化效率；“吉V130”具有相对较好的农艺性状且转化效率高于A188和Hi-II，在今后玉米转基因研究工作中将发挥重要的作用。
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作者：尚丽霞 于志晶 蔡勤安 孟凡钢 曾军 林秀峰 马瑞 单位：吉林省农业科学院农业生物技术研究所
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