１细胞生物学特性
１.１细胞活力测定
采用Ｔｒｙｐａｎｂｌｕｅ拒染试验检测冻存前及复苏后细胞的存活率。将待检细胞制成细胞悬液，取细胞悬液与０４％台盼蓝溶液以９∶１混合均匀（使台盼蓝溶液终浓度为００４％），３ｍｉｎ后观察，并用血球计数板计数。镜下观察可见健康活细胞胞体完整、细胞透明、不着色，凡着色呈蓝色者均为死细胞。计数１０００个细胞，计算细胞活率。
１.２生长曲线绘制
向２４孔培养板每孔内接种１ｍＬ密度约为１×１０４个／ｍＬ细胞，从接种之日算起，每隔２４ｈ计数２个孔内的细胞密度，算出平均值，连续测定１２ｄ，以培养时间为横坐标，以细胞密度为纵坐标，绘制细胞生长曲线。
１.３细胞染色体分析
选取第４代生长良好的新生昆明犬成纤维细胞，按照常规方法［９］进行染色体制片，Ｇｉｍｅｓａ染色后选择染色体分散与形态良好的分裂相在油镜下观察拍照，作核型图，对５０～１００个分裂中期细胞进行染色体数目统计。
２结果与分析
２.１细胞的形态学观察
新生昆明犬耳缘皮肤组织经胶原酶分离培养３～４ｄ后，镜下观察可见有少数细胞沿组织块边缘慢慢贴壁伸展，细胞形状不规则，且其组织块的生长晕形成时间较长。经８～１０ｄ培养才出现大量成片生长的优势细胞，此时观察细胞的形态呈长梭形、多角形或扁平星形，为典型的成纤维细胞形态。后再经３～４ｄ细胞生长至汇合，并长满整个细胞培养瓶表面（图１Ａ），此时可进行传代和冻存。传代后的细胞生长旺盛，在形态上与原代细胞无明显差异，经２～３ｄ即可长至近１００％汇合，此时细胞呈放射状或涡旋状走势（图１Ｂ）。待传代时，加入消化液后显微镜下可见细胞回缩，呈圆形（图１Ｃ）。
２.２成纤维细胞冻存前和复苏后的活
耳部成纤维细胞冻存前和复苏后的活率分别为９３３％，９０８％（图２）。冻存前与复苏后的细胞存活率差异不显著（Ｐ＞００５），说明原代细胞和传代细胞生长状态良好，培养条件适宜，且冻存和复苏的过程对细胞活力状况损害较小。
２.３生长曲线
根据昆明犬耳部成纤维细胞接种于２４孔板连续培养１２ｄ的细胞计数情况，绘制出了成纤维细胞的生长曲线（图３）。昆明犬耳部成纤维细胞的生长曲线呈典型的“Ｓ”形，即经过了潜伏生长期、对数生长期、平台期以及衰亡期。其表现为１～２ｄ的潜伏生长期细胞总数基本保持不变，从第３天起，细胞数量开始增加，３～８ｄ左右细胞明显地进入对数生长期，细胞数量快速增长，第８～９天，细胞由于缺乏足够生长空间而增长放缓，开始进入平台期。第９天后，由于细胞数量的急剧增加、生长空间的极大限制，经过短暂的平台期后，细胞发生接触抑制快速进入衰亡期，细胞生长几乎停止，随后细胞逐渐脱落死亡，此时镜下可见有大量凋亡细胞漂浮。由生长曲线上的数据分析，耳部成纤维细胞群体倍增时间约为３２ｈ。
２.４核型观察分析
昆明犬耳部成纤维细胞中期染色体分裂相与核型分析如图４所示：染色体数目２ｎ＝７８（ＸＸ）。计数８０个４代细胞的染色体数目，总数２ｎ＝７８的细胞数约占总细胞数的９０％，达到了建立细胞系７５％～８０％的要求，说明所建细胞系为稳定的二倍体细胞系。３９对染色体中有３８对常染色体均为端着丝粒（Ｔ）染色体，长度逐渐递减；性染色体Ｘ，Ｙ均为中央着丝粒（Ｍ），Ｘ染色体的长度最大。
３讨论
目前，国内已有一些研究报道建立了比格犬胎儿成纤维细胞系［１０］、德国牧羊犬耳部和腹部成纤维细胞系［１１］及杂交犬大腿内侧皮肤成纤维细胞系［１２］等，但利用犬类的这些细胞遗传资源进行更加广泛深入的研究（如医疗和动物模型的建立、体细胞克隆等）还十分欠缺。在国外，已有较多使用所建立的犬胎儿或成体成纤维细胞系进行体细胞核移植（ＳＣＮＴ）的研究［１３－１６］。值得注意的是，在警用工作犬领域，７头世界首批体细胞克隆警犬于２００７年底在韩国诞生［１７］，２００９年韩国克隆专家根据美国９１１英雄警犬“特拉克”的遗传信息，再次利用体细胞克隆技术成功获得了５头牧羊犬（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗｃｎｗｎｅｗｓｃｏｍ／ｈｔｍｌ／ｔｅｃｈ／ｃｎｋｐｚｓ／２００９０６２１／１２２１７１ｈｔｍｌ）。ＬＥＥ等［１８］将曾服役于韩国国家紧急事务管理署（ＮＥＭＡ）具有６年全球救援经验的退役搜救犬进行克隆，最终获得２头克隆犬。这些克隆后代中大多数工作犬已服役并具备与父辈同样卓越的工作性能。同时，ＯＨ等［１９］的研究也表明，利用ＳＣＮＴ技术将能使一头优秀的检验检疫犬复制出一群同样优秀的检验检疫犬。体细胞克隆技术最大的优势在于克隆出生的动物与供体细胞来源的动物具有几乎１００％相同的基因，即能完全保持亲代优异的先天特质。要成为一只优秀的警犬，就必须要具备高智商、敏锐的嗅觉、良好的亲和能力等警犬所必备的各种特质。按照传统的警犬繁育方式，培育出一头优秀警犬至少需要３～４年时间，花费约１０万元，期间要消耗大量的人力、物力和时间，且培训的优秀率低，不超过１２％；而要培养出一头功勋级的警犬需要付出的代价就更大，最少需数１０人，４～５年时间，约５０万元的费用，且培养出一头功勋级警犬的效率很低，约８‰。而动物体细胞克隆技术可以批量复制优秀、功勋级的警犬，可以大大降低培育成本，提高培养功勋警犬的培育效率。因此，体细胞核移植技术在警犬繁育中具有广阔的应用前景。然而，体细胞核移植技术首先必须要解决的是供体细胞的来源和体细胞分离培养的问题。本研究利用胶原酶消化法建立了新生昆明犬耳部成纤维细胞系，并对其体外培养的生物学特性也进行了初步的分析与探讨。在动物成纤维细胞的体外分离培养中，分离组织可以取自胎儿、新生幼仔及成体动物［２０－２２］。其中，胎儿取材不仅难度大、成本高，且对优良品种的保存也十分不利。相反地，新生幼仔或成体动物耳部、腹部及腹股沟等部位皮肤组织的取材则显得十分便捷，且不影响动物的健康成长。本试验取材自新生昆明犬耳缘皮肤组织（＜１ｃｍ２），对于新生仔犬，其伤口愈合快、皮肤组织修复能力强，应激性小且容易护理。另外，新生幼犬较成犬组织分化程度低，其成纤维细胞理论上应具有较强的增殖能力、易培养及适于进行相关基因操作研究。本试验所建立的新生昆明犬耳部成纤维细胞具有典型的成纤维细胞形态，如细胞呈梭形或星形，当生长至汇合时细胞会平行排列，呈涡旋状和放射状生长。其冻存前和复苏后存活率差异不显著（Ｐ＞００５），细胞复苏后增殖快、生命力旺盛，且形态未发生变化。这表明冻存和复苏过程中的各项条件对细胞活力影响较小，试验中采用的冻存和复苏的方法是可行的。
在离体培养条件下，昆明犬耳部成纤维细胞生长曲线遵循典型的“Ｓ”形，细胞接种后有１～２ｄ的潜伏期，从第３天起细胞进入对数生长期，约６ｄ后细胞长满细胞瓶后进入平台期，细胞进入接触抑制状态，增殖缓慢，随后细胞生长状态下降，部分细胞开始死亡。这与宁小檬等［１１］描述的德国牧羊犬耳部皮肤成纤维细胞的生长曲线完全一致，并与叶雷等［２３］描述的版纳微型猪近交系成年猪耳部成纤维细胞的生长曲线基本一致。在细胞培养中，昆明犬耳部成纤维细胞体外培养的生长速度会随着细胞培养代数的增加而变慢，细胞的适应期增长，当细胞传代到１２代时就明显开始老化，增殖减慢，细胞形态变大，胞内出现大量空泡状颗粒物，到１５代时已基本停止增殖。该现象的产生可能是由于细胞本身端粒酶长度的缩短或体外培养环境对细胞ＤＮＡ造成的损伤，从而导致细胞的遗传稳定性有所改变［２４］。在进行核型制备分析时，由于犬染色体较多（７８条），其中３８对常染色体均为端着丝粒染色体且长度逐渐递减，因此犬的染色体核型分析也成为哺乳动物中最困难的核型分析之一［２５］。由于很多常染色体的着丝粒不明显，着丝粒与长臂末端容易混淆，致使核型排列时容易导致染色体方向的颠倒。然而，在本试验中利用Ｇ带技术进行核型分析，使染色体形态鉴定、同源染色体配对、核型排列都较为准确。昆明犬染色体数目及核型特征与已报道的其他犬的染色体核型分析结果基本一致［２５－２６］。但随着染色体长度的减短，Ｇ带带纹数目减少且不够清晰，今后需要进一步改进试验方法进行深入研究。综上所述，本研究成功地建立了昆明犬成纤维细胞系，弥补了昆明犬成纤维细胞培养与生物学特性研究的空白。同时，该细胞系的建立对于昆明犬种质资源的保存以及相关繁殖生物技术研究具有重要的意义。此外，随着细胞工程和基因操作技术的发展和成熟，建立稳定的新生昆明犬体细胞系是开展功勋犬的体细胞克隆、犬的疾病模型构建等各项研究的基础。
作者：韦云芳 毛爱国 万九生 李静 李鸿辉 陈方良 袁再美 杜晓鹏 唐树生 魏红江 单位：公安部昆明警犬基地 云南农业大学动物科学技术学院 云南农业大学 云南省动物营养与饲料重点实验室
