黑紫獐牙菜SwertiaatroviolaceaH.Smith为龙胆科（Gentianaceae）獐牙菜属SwertiaL.多年生草本植物，生于海拔3400～4575m的山坡草地、多石山顶或岩石缝中，是云南省迪庆藏族地区特有品种[1]。獐牙菜属植物全球约有170种，中国有80种，主要分布于云南、四川等地，云南有38种。在我国该属植物入药历史悠久，药用有35种，具有清热利胆、除湿解毒等功效，常用于治疗急性黄疽型肝炎、骨髓炎等疾病[2]。该属植物中的化学成分丰富，主要有酮、黄酮、环烯醚萜、三萜及其苷类和生物碱等化合物[3]。近期研究发现獐牙菜属植物提取物在抑制由性传播的病毒（包括HIV）、抗皮肤癌、抗HBV、神经保护作用等方面也具有较好的活性[4-5]。在前期工作中，本课题组对獐牙菜属植物开展了化学成分及生物活性研究，从该属植物中发现了酮及其苷类、环烯醚萜及其苷类等化合物，并对这些成分进行了生物活性鉴定，发现其具有抗菌消炎、抗烟草花叶病毒（TMV）、降血糖和抗肿瘤等功效[6-8]。为了进一步研究獐牙菜属植物的活性成分及药用价值，本实验对云南迪庆藏族地区的黑紫獐牙菜进行研究，从该植物95%乙醇提取物中分离得到5个化合物，分别鉴定为3-(3-甲基-2-氧代-丁-3-烯基)-6-乙酰基-1,5-二甲氧基酮[3-(3-methyl-2-oxobut-3-enyl)-6-acetyl-1,5-dimethoxy-xanthone，1]、1,2,3,4-四氢-1,4,6,8-四羟基酮（1,2,3,4-tetrahydro-1,4,6,8-tetrahydroxy-xanthone，2）、1,3-二甲氧基-8-羟基酮（1,3-dimethoxy-8-hydroxy-xanthone，3）、1,2,6,8-四羟基酮（1,2,6,8-tetrahydroxy-xanthone，4）、熊果酸（ursolicacid，5）。其中，化合物1为新的酮类化合物，命名为黑紫獐牙菜素A。对该化合物进行了细胞毒活性测定，发现其对急性早幼粒细胞白血病细胞（NB4）、人肺腺癌细胞（A549）、人神经母细胞瘤细胞（SHSY5Y）、人前列腺癌细胞（PC3）、人乳腺癌细胞（MCF-7）的IC50值均小于10μmol/L，其中对A549和MCF-7细胞具有较高的细胞毒活性，其IC50值分别为5.2和3.8μmol/L。
1材料与方法
UV-2401A紫外光谱仪（日本岛津公司）；JBio-RadFTS-185傅里叶变换红外光谱仪（美国伯乐BIO-RAD公司）；DRX-500核磁共振仪（瑞士布鲁克公司）；半制备HPLC分析仪器为岛津LC-8A型高效液相色谱仪，色谱柱为安捷伦公司ZorbaxPrepHTGF（250mm×21.2mm，7μm）和安捷伦ZorbaxC18（250mm×9.4mm，5μm）色谱柱。柱色谱硅胶、GF254（100mm×100mm）硅胶板，均为青岛海洋化工厂产品；MCI填充材料为MCI-gelCHP-20P（75～150μm，日本三棱公司生产）；凝胶为SephadexLH-20，美国GE公司产品；提取及柱色谱使用重蒸工业纯三氯甲烷、甲醇、醋酸乙酯、石油醚；色谱纯乙腈、四氢呋喃；超纯水。植物样品于2012年11月采自云南省迪庆藏族地区，经云南民族大学杨青松博士鉴定为黑紫獐牙菜SwertiaatroviolaceaH.Smith，标本（1301006）存于民族药资源化学国家民委—教育部重点实验室（云南民族大学）标本室。
2提取与分离
取样品2.5kg晒干，粉碎到30目，然后用95%乙醇提取4次，每次用量为3.5L，室温浸泡、超声4次，每次30min，滤过，减压浓缩得浸膏，合并得到浸膏86g。浸膏用MCI脱色，再经硅胶柱色谱，氯仿-丙酮（20∶1、9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5）梯度洗脱，分成6个部分。选取9∶1洗脱部分进一步经HPLC分离，以68%甲醇-水溶液为流动相，体积流量15mL/min，分别收集8.2、13.5、17.8、26.7、32.3min的色谱峰，可得化合物粗品。粗品分别再用甲醇溶解，经葡聚糖凝胶柱纯化（甲醇）得化合物1（18.2mg）、2（8.3mg）、3（10.2mg）、4（15.0mg）、5（13.1mg）。
3结构鉴定
化合物1：浅黄色粉末，HR-ESI-MS显示其准分子离子峰为403.1152[M＋Na]+，结合1H-和13C-NMR谱（表1）确定分子式为C22H20O6。其红外光谱显示羟基(3405cm1)、羰基(1708,1684,1652cm1)和芳环(1612,1569,1448cm1)信号，紫外光谱在336、258、210nm有最大吸收也证实化合物中存在芳环结构。化合物的1H-和13C-NMR谱显示其含有22个碳和20个氢，包括1个1,3,5,6-四取代的酮[δC161.4s,108.1d,140.2s,104.8d,153.9s,124.6s,125.8d,121.5d,178.1s,156.4s,124.0s,116.7s,149.3s;δH6.81(d,J=1.8Hz),6.70(d,J=1.8Hz),7.62(d,J=8.2Hz),7.48(d,J=8.2Hz)]、1个乙酰基[δC198.2s,30.4q;δH2.52(s)]、1个3-甲基-2-氧代-丁-3-烯基团[δC37.7t,201.1s,144.2s,123.9t,18.7q;δH4.66(s),5.90(s),1.94s][9]、2个甲氧基[δC56.0q,61.0q;δH3.84(s),3.87(s)]和1个羰基(C-9)。除去取代基团（1个乙酰基、1个3-甲基-2-氧代-丁-3-烯基团、2个甲氧基），根据2个苯环、羰基的核磁共振数据，结合不饱和度可推测该化合物1为酮类化合物。根据H-1′(δH4.66)和C-2(δC108.1),C-3(δC140.2),C-4(δC104.8)有HMBC相关（图1），以及H-2(δH6.81)和C-1′(δC37.7)有HMBC相关，可证实3-甲基-2-氧代-丁-3-烯基团连接在C-3位。根据乙酰甲基C-7′(δC30.4)和C-6(δC124.6)有HMBC相关，以及H-7(δH7.62)和C-6′(δC198.2)有HMBC相关，可证实乙酰基取代在C-6位。2个甲氧基取代在C-1(δC161.4)和C-5(δC153.9)位可由2个甲氧基氢(δH3.84,3.87)分别和C-1(δC161.4)、C-5(δC153.9)的HMBC相关得到确定。化合物中典型的酮氢谱信号(H-2、H-4、H-7和H-8)也可进一步证实该色酮为1,3,5,6取代[10]。因此，鉴定化合物1为3-(3-甲基-2-氧代-丁-3-烯基)-6-乙酰基-1,5-二甲氧基酮，命名为黑紫獐牙菜素A。化合物2：淡黄色粉末，分子式为C13H12O6。ESI-MSm/z:265[M＋H]+。1H-NMR(500MHz,CDCl3)δ:6.19(1H,s,H-5),6.03(1H,s,H-7),4.84(1H,t,J=6.8Hz,H-4),4.40(1H,t,J=6.8Hz,H-1),2.07(2H,m,H-3),1.85(1H,dd,J=6.4,16.0Hz,H-2a),1.73(1H,dd,J=6.4,12.3Hz,H-2b)；13C-NMR(125MHz,CDCl3)δ:82.1(C-1),28.8(C-2),26.8(C-3),64.3(C-4),160.3(C-4a),165.7(C-4b),94.6(C-5),167.0(C-6),100.4(C-7),163.1(C-8),105.4(C-8a),183.3(C-9),118.7(C-9a)。以上数据与文献报道基本一致[11]，故鉴定化合物2为1,2,3,4-四氢-1,4,6,8-三羟基酮。化合物3：淡黄色粉末，分子式为C15H12O5。ESI-MSm/z:273[M＋H]+。1H-NMR(500MHz,CDCl3)δ:13.1(1H,s,8-OH),7.72(1H,dd,J=1.6,8.2Hz,H-7),7.32(1H,t,J=7.8Hz,H-6),7.27(1H,dd,J=1.4,8.2Hz,H-5),6.52(1H,d,J=2.4Hz,H-2),6.30(1H,d,J=2.0Hz,H-4),3.99(3H,s,1-OCH3),3.92(3H,s,3-OCH3)；13C-NMR(125MHz,CDCl3)δ:181.2(C=O),166.3(C-3),162.2(C-1),157.1(C-4a),148.8(C-8),144.8(C-4b),124.5(C-6),121.6(C-8a),114.6(C-7),115.9(C-5),103.2(C-8b),97.7(C-2),94.3(C-4),56.1(1-OCH3),55.9(3-OCH3)。以上数据与文献报道基本一致[12]，故鉴定化合物3为1,3-二甲氧基-8-羟基酮。化合物4：黄色粉末，分子式为C13H8O6。ESI-MSm/z:237[M＋H]+。1H-NMR(500MHz,CDCl3)δ:6.27(1H,d,J=1.6Hz,H-5),6.37(1H,s,H-7),6.60(1H,d,J=8.8Hz,H-3),7.35(1H,d,J=8.8Hz,H-4)；13C-NMR(125MHz,CDCl3)δ:146.1(C-1),138.5(C-2),126.6(C-3),111.4(C-4),154.7(C-4a),157.3(C-4b),93.5(C-5),166.2(C-6),99.8(C-7),162.3(C-8),101.8(C-8a),107.7(C-8b),185.7(C-9)。以上数据与文献对照一致[13]，故鉴定化合物4为1,2,6,8-四羟基酮。化合物5：白色晶体，分子式C30H48O3。ESI-MSm/z:457[M＋H]+。1H-NMR(500MHz,CDCl3)δ:7.29(1H,s,COOH),5.04(1H,m,J=3.6Hz,H-12),3.79(1H,m,H-3),2.69(1H,m,H-18),2.39(2H,m,H-15),2.12(2H,q,J=12.0Hz,H-16),2.00(2H,t,J=8.0Hz,H-22),1.97(1H,m,H-19),1.94(2H,s,H-11),1.82(2H,m,H-21),1.63(2H,m,H-6),1.42(2H,m,H-1),1.31(1H,m,H-5),1.21(3H,d,J=7.6Hz,H-30),1.07(3H,s,H-23),1.04(3H,s,H-24),0.94(3H,d,J=6.4Hz,H-29),0.86(3H,s,H-27),0.82(3H,s,H-26)；13C-NMR(125MHz,CDCl3)δ:178.9(C-28),139.7(C-13),124.7(C-12),76.2(C-3),54.9(C-5),53.8(C-18),47.1(C-9),42.4(C-17),39.8(C-14),39.1(C-19),38.8(C-20),38.5(C-8),37.5(C-22),37.3(C-4),33.6(C-10),31.5(C-1),30.1(C-7),28.9(C-11),28.4(C-2),28.2(C-21),25.0(C-15),24.0(C-16),23.7(C-23,C-24),20.5(C-6),18.8(C-27),15.6(C-25),17.5(C-26),16.8(C-29),15.7(C-30)。以上数据与文献报道一致[14]，故鉴定化合物5为熊果酸。
4化合物1的细胞毒活性研究
参照文献报道[15]，采用MTT法测定化合物1的细胞毒活性，以紫杉醇为阳性对照，测试细胞株为NB4、A549、SHSY5Y、PC3和MCF7，均购于上海拜力生物科技有限公司。结果表明：化合物1对5株细胞的IC50值均小于10μmol/L，其中对A549和MCF-7细胞具有较高的细胞毒活性，其IC50值分别为5.2和3.8μmol/L。表明其对A549和MCF-7细胞有显著的细胞毒活性。
作者：蒋薇 左马怡 杨青松 曾亮 杨淬 李干鹏 单位：云南民族大学化学与生物技术学院 民族药资源化学国家民委-教育部重点实验室
