1材料
1.1药材
阿胶样品购买自5个不同生产厂家（分别以代号A、B、C、D、E表示），批号分别为110914、1211011、121003、121104、1197481，样品均为长方形块状，黑褐色，有光泽，气微，味微甘。全部样品均经山西大学中医药现代研究中心秦雪梅教授鉴定为驴EquusasinusL.的干燥皮或鲜皮经煎煮、浓缩制成的固体胶。
1.2试剂
蒸馏水，浓盐酸（37%，12mol/L），D2O（美国默克试剂公司），2,2,3,3-三甲基甲硅烷基氘代丙酸钠盐（TSP，质量分数98%，CambridgeIsotopeLaboratories，Inc.）。
1.3仪器
Bruker600-MHzAVANCEIII核磁共振检测仪（600.13MHz）；RE-52A旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；SHZ-III真空泵（上海知信实验仪器技术有限公司）；TGL-16高速台式冷冻离心机（湘仪离心机仪器有限公司）；25mLSchott玻璃蓝盖瓶（德国DuranGroup公司）。
2方法
2.11H-NMR测试样本制备
称取阿胶粗粉25mg置于Schott蓝盖瓶中，其中加入10mL6mol/L的盐酸溶液，振摇，超声溶解，置于110℃烘箱中，恒温水解24h。取出放至室温，转移至25mL圆底烧瓶中，并用蒸馏水多次洗涤，减压蒸干，放至室温后加入D2O（内含0.015%TSP）700μL，超声助溶，转移至1.5mL离心管中，13000r/min离心20min，取600μL上清液于5mm核磁管中，待测。
2.21H-NMR测定条件
样品在25℃下于Bruker600-MHzAVANCEIIINMR检测仪上采集数据，测定频率为600.13MHz，采用预饱和水峰压制脉冲序列（noesygppr1d），参数设置：RD＝5.0s，傅里叶转换LB＝0.3Hz，PW＝30°（12.7μs），谱宽为12345.7Hz，采集65536个数据点，扫描次数32次。2.3数据处理2.3.11H-NMR图谱处理采用MestReNova核磁图谱专业处理软件对图谱进行内标（TSP）校准、相位校准及基线校准等规格化处理。以δ0.01为单位，切除δ4.50～4.90水峰区域，对δ0.85～8.70区域的谱图进行积分，将所产生的积分数据进行归一化处理。2.3.2多元统计分析采用SIMCA-P13.0软件将1H-NMR采集处理的积分数据进行中心化和规格化后，进行主成分分析（PCA）、偏最小二乘判别分析（PLS-DA）模型验证，并用正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）结合独立样本t检验找出差异化学成分。
3结果
3.11H-NMR图谱的指认与分析
结合每个化学成分的化学位移，裂峰情况及ChenomxNMRSuite（ChenomxInc.，Edmonton，AB，加拿大）专业数据库，对所得图谱进行分析，共指认出了17种化合物（图1），主要成分为氨基酸和有机酸，指认结果见表1。
3.21H-NMR代谢组学数据分析
采用PCA分析法对A、B、C、D、E厂家的阿胶1H-NMR代谢轮廓进行分析，所得结果见图2。从图中可以看出，不同厂家的阿胶具有一定程度的差异性。同时可以明显发现，A、B厂家阿胶的主成分较接近，而其余3个厂家（C、D、E）的主成分较接近，并且A、B与C、D、E沿t[1]轴明显分开。为了进一步分析不同生产厂家的阿胶在化学成分上的差异性，选取B厂家阿胶作为对照，而其余厂家的阿胶与其进行OPLS-DA分析。而OPLS的使用必须以PLS模型通过验证为基础。排列实验是一种外部模型验证方法，主要用于验证PLS-DA模型的拟合程度和预测能力分析[24]。PLS-DA的模型验证图见图3。从图3可知，PLS-DA模型排列实验中左端任何一次随机排列产生的R2、Q2值均小于右端的原始值，表明原始模型的预测能力大于任何一次随机排列y变量的预测能力，即模型有效，可以做后续的差异成分寻找。所得OPLS-DA散点图及载荷图见图4。依据离原点越远的点对分组贡献越大的原则，结合由OPLS-DA分析得到的VIP值（选取前10%），找出A、C、D、E厂家阿胶与B厂家阿胶酸水解产物的差异性成分分别见图5。从图5可知，与B厂家阿胶相比，A厂家阿胶含较多乙酰丙酸，含较少赖氨酸和精氨酸；C厂家阿胶含较多乙酰丙酸、丙氨酸、亮氨酸、苏氨酸和苯丙氨酸，含较少异亮氨酸、精氨酸和羟脯氨酸；D厂家阿胶含较多乙酰丙酸、丙氨酸、亮氨酸、精氨酸和赖氨酸，含较少异亮氨酸和羟脯氨酸；E厂家阿胶含较多乙酰丙酸、丙氨酸和亮氨酸，含较少异亮氨酸、脯氨酸、丝氨酸和精氨酸，并且它们均具有显著性差异（P＜0.05）。
4讨论
本研究在阿胶的谱图中发现阿胶酸水解物中含乙酰丙酸（又称4-氧化戊酸、左旋糖酸或戊隔酮酸），该成分应来源于制备阿胶的辅料冰糖[1]水解生成的单糖在酸性及高温条件下水解所得[25-26]。并且在实验过程中发现阿胶加酸水解后出现腐黑物，该腐黑物的来源有2种可能[26]：一种为葡萄糖及其水解产物中含醛基、羟基、羧基，能够发生缩聚，生成不溶于水的高聚物或者腐黑物沉淀出来；二为高温使糖类炭化。本实验中发现，不同生产厂家阿胶外观相似，但硬度及脆度不同，有的可轻易用手掰断，有的则需借助工具。同时，不同厂家的阿胶具有不用程度的腥味，因此，可以推测它们的化学成分是有差异的，而这些差异可能来源于阿胶原材料采集地的不同及阿胶制备过程中工艺的差异等。阿胶主要有补血、抗休克、改善钙代谢平衡、调节免疫功能、止血、促进淋巴细胞转化率等药理作用。关于阿胶的药理作用机制，主要有2种学说[27]，第1种是传统药理学说，认为阿胶的许多药理作用与其所含的氨基酸和微量元素有关；第2种是聚负离子结构学说，认为阿胶中中性氨基酸和酸性氨基酸的量高，其中含甘氨酸18.83%、脯氨酸9.40%、谷氨酸8.63%，这样具备了聚负离子基结构形成的物质基础。因此，可以推测阿胶的药理作用与其所含氨基酸具有密不可分的关系，但其具体作用成分仍需进一步探索分析。综上所述，基于1H-NMR代谢组学的不同厂家的阿胶差异性成分研究是简便有效的，为阿胶的质量控制研究提供了新的方法。结合实验室前期使用RAPD分析方法对阿胶原材料驴皮与其伪品马皮的鉴别研究[28]及使用1H-NMR代谢组学对不同产地驴皮及其伪品的鉴别研究，后期将使用其他的技术如HPLC、GC-MS联用技术对阿胶进行研究，并结合药效学研究阿胶的有效作用成分，从而建立一套相对完整的阿胶质量控制体系。
作者：那丽丹 陈建丽 秦雪梅 田俊生 单位：山西大学中医药现代研究中心 山西大学化学化工学院
