１材料和方法
１．１实验动物
A５３T转基因小鼠(为半合子的转基因小鼠)购于南京大学模式动物研究所,按SPF级别饲养,置于室温(２０±２)℃,１２Ｇ１２h昼夜循环光照条件下饲养,自由取食、饮水.雌性小鼠取１７和１９月龄,雄性小鼠取１５和１７月龄,每组小鼠各６只,以相应月龄的同窝野生型(WT)小鼠各６只作为对照.
１．２子代鼠基因型鉴定
取A５３T转基因小鼠和野生型C５７BL/６小黑鼠配对合笼繁殖,取子代鼠(４~７周)的鼠尾DNA进行PCR鉴定.PCR反应上游引物:５′ＧTCATGAＧAAGACTTTCAAAGGCＧ３′,下游引物:５′ＧCCTCＧCCCCAGCCTAGACCＧ３′.PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后,在２４５bp处有特异性扩增条带的即为所需的A５３T转基因小鼠.
１．３小鼠小肠推进率的检测
取５g羧甲基纤维素钠溶于１２５mL蒸馏水中,分别加入８g奶粉、４g糖、４g淀粉和１．５g活性炭末,搅拌均匀,配制成１５０mL的黑色半固体糊状物.冰箱冷藏,用时恢复至室温.小鼠禁食１８h后,每只小鼠灌胃给予半固体糊状物０．０２５mL/g。２０min后脱颈椎处死小鼠,开腹,结扎幽门和盲肠,迅速取出小肠,轻轻剥开小肠后直铺于白纸上,测量幽门至回盲肠部全长及幽门至黑色半固体糊状物前端的距离,并按如下公式计算小鼠的小肠推进率.小肠推进率＝幽门至黑色半固体糊状物前端的距离/幽门至回盲肠部全长×１００％.
２结果
结果表明,１７和１９月龄的雌性A５３T转基因小鼠的小肠推进率分别为(６７．５２±６．９４)％和(６０．７９±５．９６)％,WT小鼠分别为(６３．４２±４．２１)％和(６６．７１±２．１２)％,两者比较差异无显著性(P＞０．０５).１５和１７月龄的雄性A５３T转基因小鼠的小肠推进率分别为(６０．８６±６．８７)％和(７４．５２±７．６９)％,WT组分别为(５７．６１±３．５１)％和(７６．３７±４．３４)％,两组比较差异无显著性(P＞０．０５).
３讨论
PD主要的病理改变为中枢神经系统内αＧ突触核蛋白的聚集和沉积[６].点突变造成αＧ突触核蛋白第５３位丙氨酸(Ala)突变为苏氨酸(Thr),突变后αＧ突触核蛋白N端的螺旋形结构发生变化[７],在氧化应激等条件下更容易形成寡聚体,这种可溶性的寡聚体对神经元有毒性作用,从而引起PD的早期病变.将人突变型的αＧ突触核蛋白通过转基因技术插入到小鼠的基因组中,得到携带人A５３T突变型αＧ突触核蛋白的转基因小鼠即A５３T转基因小鼠,A５３T小鼠能够成功地复制出PD的病理和行为特征[８].胃肠功能障碍是PD早期的非运动症状表现之一,PD病人在临床症状出现前数年就已发生胃肠道功能的紊乱.A５３T转基因小鼠在嗅觉、学习记忆及运动等方面均出现了不同程度的下降[９],说明该动物模型也许可模拟人类PD早期小肠运动功能紊乱的症状[１０].本实验采用营养性的半固体糊状食物,其营养成分非常接近小鼠的日常饮食,故能够更好地反映小鼠小肠的运动功能.结果显示,无论是１７、１９月龄雌性,还是１５、１７月龄雄性A５３T转基因小鼠的小肠运动功能都尚未出现损伤性的变化.DICKSON等[１１]认为,PD病人中小肠运动障碍的原因可能与中枢神经系统、神经递质的变化及肠神经系统变性有关系,病人脑干迷走神经背核变性,神经元缺失,释放的乙酰胆碱减少,从而导致小肠蠕动减弱.但在A５３T转基因小鼠中,小肠运动功能障碍的发生机制复杂,例如个体之间随机拷贝的突变基因数目可能存在不同程度的差别,因此对胃肠运动功能障碍的影响可能不尽相同.本研究结果显示,１５~１９月龄的野生型小鼠,与同月龄A５３T转基因小鼠的小肠运动功能没有显著性差别.因此,下一步工作中,我们将筛选月龄较小的和携带的特定突变基因表达水平一致的A５３T转基因小鼠进行研究,进一宏观经济论文步完成对其小肠运动功能的评价.
作者：赵晨阳 王维维 宋宁 姜宏 单位：青岛大学国家生理学重点(培育)学科
