１材料和方法
１．１标本和细胞株
食管癌标本均来自北京友谊医院２０１０年１２月－２０１３年１２月胸外科收治的食管癌患者手术切除的新鲜标本。立即将每例癌组织及其邻近（距癌缘５ｃｍ）的正常组织置液氮中保存备用。所有病例均经过病理组织学证明。食管癌细胞ＥＣＡ－１０９细胞系来自中国科学院上海细胞所。
１．２实验材料
Ｔｒｉｚｏｌ试剂盒为美国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司产品；逆转录试剂盒ＦＳＱ－１０１为日本Ｔｏｙｏｂｏ公司产品；荧光定量ＰＣＲ试剂盒为美国Ｂｉｏ－Ｒａｄ公司产品；ＤＭＥＭ培养基和胎牛血清均购自美国Ｈｙｃｌｏｎｅ公司；ｃｏｎｔｒｏｌｓｉＲＮＡ，ＦＡＴ１０ｓｉＲＮＡ，ＦＡＴ１０抗体和甘油醛－３－磷酸脱氢酶（ＧＡＰＤＨ）抗体均购自美国ＳａｎｔａＣｒｕｚ公司；ｐ－Ａｋｔ，Ａｋｔ，ｐ－ＧＳＫ３β和ＧＳＫ３β均购自美国ＣＳＴ公司；Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００和蛋白裂解液均购自美国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司；ＭＴＴ试剂购自美国Ｓｉｇｍａ公司。
１．３方法
１．３．１ＲＴ－ＰＣＲ检测ＦＡＴ１０基因ｍＲＮＡ的表达按Ｔｒｉｚｏｌ试剂盒说明书提取ＲＮＡ，分别取食管癌和癌旁正常黏膜组织各１００ｍｇ，在液氮中碾碎至粉末，加入１ｍｌＴｒｉｚｏｌ裂解细胞１０ｍｉｎ，提取总ＲＮＡ。按所用逆转录试剂盒说明书将总ＲＮＡ转录成ｃＤＮＡ。ＰＴ－ＰＣＲ反应体系：１μｌ逆转的ｃＤＮＡ（终溶度为５ｎｇ）、２×ＳＹＢＲＰｒｅｍｉｘＥｘＴａｑＴＭＩＩＭｉｘ１０μｌ，上游引物０．５μｍｏｌ／Ｌ，下游引物０．５μｍｏｌ／Ｌ，ＤＥＰＣＨ２Ｏ８μｌ，总体积为２０μｌ。反应条件：９５℃３０ｓ，９５℃５ｓ，６０℃１５ｓ，７２℃２０ｓ，扩增３５个循环。以ＧＡＰＤＨ为内参，采用２－△△ＣＴ法对结果进行分析。
１．３．２Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ按蛋白提取试剂盒说明书提取组织或者肿瘤细胞总蛋白，ＢＣＡ蛋白浓度测定法对蛋白样品进行定量。取５０μｇ总蛋白于１０％聚丙烯酰胺凝胶中电泳。用半干式电印迹将蛋白转移至ＰＶＤＦ膜上，５％脱脂牛奶封闭１ｈ后，分别加入相应一抗（用含５％脱脂奶粉的ＴＢＳＴ配制；１∶１０００稀释），４℃过夜，第二天室温平衡４０ｍｉｎ，洗膜后分别加入辣根过氧化物酶标记的二抗，３７℃孵育１ｈ，洗膜后加增强化学发光试剂（ＥＣＬ），将膜放入Ｘ线片暗盒、压片、显影、定影，以ＧＡＰＤＨ的表达作为参照，目的条带的灰度值与内参条带的灰度值比较。
１．３．３ＦＡＴ１０ｓｉＲＮＡ转染人食管癌细胞株ＥＣＡ－１０９用含１０％胎牛血清及１％青霉素和１％链霉素的高糖型ＤＭＥＭ培养液培养于３７℃、５％ＣＯ２、饱和湿度的培养箱中。取对数生长期的ＥＣＡ－１０９细胞接种于相应培养板中，具体分组情况为：空白对照组（ｂｌａｎｋｃｏｎｔｒｏｌ）、转染试剂对照组（Ｌｉｐ－２０００）、阴性ｓｉＲＮＡ对照组（ｓｉＲＮＡＮｅｇ）和ＦＡＴ１０ｓｉＲＮＡ干扰组，每组设重复３孔。转染步骤简述如下：细胞接种于培养板中（６孔板２ｍｌ，２４孔板１ｍｌ，９６孔板１００μｌ）；无抗生素ＤＭＥＭ培养液中培养过夜至细胞融合度约７０％时，转染细胞，ｓｉＲＮＡ的最终浓度为２０ｐｍｏｌ／ｍｌ（６孔板加入总体积１００μｌ的ｓｉＲＮＡ－转染试剂混合物，２４孔板５０μｌ，９６孔板１５μｌ）；转染６ｈ后换成完全培养液，培养至相应的时间用于后续相关指标检测。
１．３．４ＭＴＴ检测细胞增殖取５×１０３个细胞接种于９６孔板，分组及转染方法同上，每组设５个复孔。分别于转染２４、４８、７２ｈ后，弃去培养液，ＰＢＳ缓冲液冲洗２次，每孔加入０．５％ＭＴＴ溶液，置细胞培养箱中培养４ｈ后取出，每孔加入２００μｌＤＭＳＯ，低速振荡１０－１５ｍｉｎ，待结晶物充分溶解后，酶标仪上于４９０ｎｍ波长处测量各孔的吸光度值（ＯＤ值）。按生长抑制率＝（１－实验组平均ＯＤ值／空白对照组平均ＯＤ值）×１００％，计算转染后细胞生长抑制率。
１．３．５流式细胞技术分析细胞周期分布和细胞凋亡取５×１０４个细胞接种于２４孔板，分组及转染方法同上，每组设３个复孔。收集转染４８ｈ后的各组细胞，用ＰＢＳ洗涤２次，１０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ。弃上清液，缓慢加入－２０℃预冷的７５％乙醇，４℃保存。取细胞悬液，ＰＢＳ洗涤，２０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ后，弃上清液。ＰＩ染液１．０ｍｌ染３０ｍｉｎ，４８８ｎｍ激发波长测定样品，６２０ｎｍ带通滤片检测ＰＩ荧光。每样本收集多于１×１０４个荧光信号，得出各期细胞数占细胞总数的百分率。
１．４统计学方法采用ＳＰＳＳ１２．０统计软件进行分析。实验数据以均数±标准差（珋ｘ±ｓ）表示，两组间均数比较采用ｔ检验；多组均数间比较采用单因素方差分析，以Ｐ＜０．０５为差异有统计学意义。
２结果
２．１ＦＡＴ１０在食管癌组织中的表达情况ＲＴ－ＰＣＲ结果显示，在３０例人食管癌组织中ＦＡＴ１０的表达量较癌旁正常黏膜组织明显上调（Ｐ＜０．０５）。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ结果亦显示ＥＣＡ组织的ＦＡＴ１０表达量增高，条带灰度增强。
２．２ＦＡＴ１０ｓｉＲＮＡ转染对ＥＣＡ－１０９细胞增殖的影响转染后２４、４８、７２ｈ，干扰组ＯＤ值明显低于对照组，差异具有统计学意义（Ｐ＜０．０５）。干扰组细胞生长受到抑制，生长抑制率在转染后２４、４８、７２ｈ分别为２３．２６％、５６．２５％和６７．８６％。２．３流式细胞术（ＦＣＭ）检测下调ＦＡＴ１０对ＥＣＡ－１０９细胞周期分布及凋亡的影响ＦＣＭ结果显示，转染ＦＡＴ１０ｓｉＲＮＡ４８ｈ后，四个组之间细胞周期各时相细胞数的差异无统计学意义（Ｐ＞０．０５）。但是观察到ＦＡＴ１０ｓｉＲＮＡ对ＥＣＡ－１０９细胞有促凋亡作用，与对照组相比，干扰组的细胞凋亡率显著升高，差异具有统计学意义（Ｐ＜０．０５）。
２．４下调ＦＡＴ１０对食管癌细胞ＥＣＡ－１０９中Ａｋｔ／ＧＳＫ３β信号通路的影响Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测发现，ＥＣＡ－１０９细胞中抑制ＦＡＴ１０的表达后，Ａｋｔ和ＧＳＫ３β的磷酸化水平都明显下降，但总的Ａｋｔ和ＧＳＫ３β表达没有明显变化。
３讨论
食管癌的发病机制涉及到多个肿瘤相关基因的异常表达及其参与的多个信号通路的异常［７－８］。类泛素蛋白ＦＡＴ１０是近年来新发现的一个癌基因，其异常表达与多种肿瘤的发生和进展密切相关。我们研究发现，食管癌组织中ＦＡＴ１０的表达明显上调，提示ＦＡＴ１０蛋白表达的改变可能在食管癌的发生发展、浸润和转移过程中起重要作用。为了探讨ＦＡＴ１０蛋白调控食管癌进展的分子机制，我们进行了一系列细胞功能实验。我们利用ＦＡＴ１０ｓｉＲＮＡ抑制ＥＣＡ－１０９食管癌细胞中ＦＡＴ１０的表达，并观察其细胞生物学行为改变。通过ＭＴＴ法检测细胞增殖，发现干扰组细胞增殖受到明显抑制，转染７２ｈ后抑制率达６７．８６％。这一结果表明下调食管癌细胞中ＦＡＴ１０的表达可以抑制肿瘤细胞生长，与在结肠癌［９］和肝癌［１０］中的研究相一致。在肿瘤进展中，除了肿瘤细胞的异常增殖，更重要的是肿瘤细胞发生凋亡的能力和倾向降低了。研究发现，抑制食管癌细胞ＥＣＡ－１０９中ＦＡＴ１０蛋白表达４８ｈ后，肿瘤细胞周期各时相的分布无明显差别，但是ＦＡＴ１０ｓｉＲＮＡ组凋亡细胞比例显著增加。这些结果表明在ＥＣＡ－１０９细胞中，ＦＡＴ１０蛋白表达下调导致细胞生长抑制的可能机制是通过促进细胞凋亡而非细胞周期阻滞来实现的。众所周知，Ａｋｔ／ＧＳＫ３β信号通路是调控细胞凋亡和存活的重要通路。研究证实，Ａｋｔ以及ＧＳＫ３β磷酸化水平下降将导致多种肿瘤细胞的凋亡［１１－１２］。本研究发现，抑制ＦＡＴ１０蛋白的表达后，ＥＣＡ－１０９细胞中Ａｋｔ和ＧＳＫ３β磷酸化水平均明显下降。这些结果表明ＦＡＴ１０表达下调诱导食管癌细胞凋亡可能是通过抑制Ａｋｔ／ＧＳＫ３β信号通路来实现的。总之，本研究发现食管癌组织中ＦＡＴ１０基因的表达显著上调，利用ＲＮＡ干扰技术抑制食管癌细胞中ＦＡＴ１０基因的表达明显促进食管癌细胞凋亡，继而抑制食管癌细胞生长，进一步研究发现ＦＡＴ１０通过抑制Ａｋｔ／ＧＳＫ３β信号通路调控食管癌细胞的凋亡。该研究为探讨ＦＡＴ１０基因在食管癌发生发展作用的前期工作，将为后续深入研究提供理论基础。
作者：胡健 单位：都医科大学附属北京友谊医院胸外科
