1实验方法
实验原料预处理鳕鱼肝脏，自然解冻后，经研钵研碎制备肝脏匀浆，于－20℃冷藏备用。淡碱水解法提取鳕鱼肝油实验取适量预处理后的鳕鱼肝脏至锥形瓶中，以料液比1∶2加入一定量的蒸馏水，将锥形瓶置于恒温振荡器中，升温至50℃，用5%NaOH溶液调节pH至8．0，于50℃下水解反应10min;继续升温至80℃，用5%NaOH溶液调节pH至9．0，于80℃下水解反应60min后加入10%NaCl盐析，趁热离心，收集上层油相，备用。酶解法提取鳕鱼肝油单因素实验取适量预处理后的鳕鱼肝脏置于锥形瓶中，按不同料液比，加入一定pH的柠檬酸－柠檬酸钠缓冲溶液，再加入一定量的木瓜蛋白酶，混合均匀，将锥形瓶置于恒温振荡器中，于一定温度下，酶解提取一定时间，酶解完全后，趁热离心(20min，3500r/min)，分离上层油相。分别以酶量、酶解pH、酶解温度、料液比、酶解时间为考察因素，以鳕鱼肝油提取率为指标，进行单因素实验。酶解法提取鳕鱼肝油优化实验采用响应面实验设计，应用DesignExpert8．0．6软件，以酶解法单因素实验结果为基础，以酶量(A)、酶解pH(B)、酶解温度(C)为主要影响因素，进行响应面分析，优化酶解法提取鳕鱼肝油工艺，因素水平设计见表1。酶解法与淡碱水解法所得鱼油的品质对比酶解法与淡碱水解法所得鱼油，从提取率、颜色、气味、酸价、过氧化值和碘价等方面进行比较，从而得到提取鳕鱼肝油的最佳提取工艺。感官及理化性质分析采用SC/T3502—2000进行感官评价;采用GB/T5530—2005测定酸价;采用GB/T5538—2005测定过氧化值;采用GB/T5532—2008测定碘价。
2结果与分析
2．1单因素实验结果与分析
2．1．1料液比对鳕鱼肝油提取率的影响由图1可知，在1∶0．5～1∶2．5范围内，随着料液比的减少，鳕鱼肝油提取率先平缓升高，后快速下降，提取率最高为92．32%，最低为84．61%。料液比在1∶0．5～1∶1．5范围内，提取率随着料液比的减少而平缓升高;当料液比小于1∶1．5后，提取率随着料液比的减少而快速降低。加入适量缓冲溶液后，酶与底物充分接触，脂肪酸溶出增加，因此提取率升高;料液比过低，酶浓度分布不均，与底物不能充分反应，提取率降低;而料液比过高，底物浓度减少，酶与底物接触机会减少，提取率降低。综合考虑提取率和经济成本，选择料液比为1∶1．5。2．1．2酶解pH值对鳕鱼肝油提取率的影响由图2可知，pH在5．5～7．5范围内，鳕鱼肝油的提取率随着pH的升高先逐渐升高后快速下降，提取率最高为92．59%，最低为82．14%。pH在5．5～6．5范围内，提取率随着pH的升高而升高;当pH大于6．5时，提取率随着pH的升高而降低。在最适pH时，酶的活力最大，提取率最高，pH过高或过低都会导致酶失活，从而使鳕鱼肝油提取率下降，所以选择酶解pH为6．5。2．1．3酶量对鳕鱼肝油提取率的影响由图3可知，在2600～3900U/g范围内，随着酶量的增加，鱼肝油提取率先平缓升高，后缓慢下降，提取率最低为87．89%，最高为93．44%。酶量在2600～3250U/g范围内，提取率随着酶量的增加而升高;当酶量达到3250U/g后，提取率趋于平缓，继续增加酶量，提取率有所下降。原因是酶浓度过高，酶自身水解加强，酶对底物的水解受到阻碍。由于酶的价格较高，综合考虑提取率和经济效益，选用酶量为3250U/g。2．1．4酶解温度对鳕鱼肝油提取率的影响由图4可知，在40～60℃范围内，随着温度的升高，鳕鱼肝油提取率先快速升高，后缓慢下降，提取率最低为68．78%，最高为91．36%。在40～50℃范围内，随着温度的升高，提取率逐渐增加;达到50℃时，鱼肝油提取率达到最高，50℃以后随着温度的升高，提取率逐渐降低。在一定范围内，酶促反应随着温度的升高，反应速率逐渐加快，且利于破乳;温度过高，酶变性失活，酶的反应速率下降，鱼肝油提取率降低，且温度过高鳕鱼肝油易被空气氧化，品质降低。综合考虑酶解效率和降低能耗，选择酶解温度为50℃。2．1．5酶解时间对鳕鱼肝油提取率的影响由图5可知，鳕鱼肝油提取率随着时间的延长逐渐升高，2h时提取率达到最高，继续延长时间，提取率保持稳定。延长酶解时间，鳕鱼肝油颜色由淡黄色变为红棕色，鳕鱼肝油含有丰富的不饱和脂酸，随着提取时间的延长，鳕鱼肝油容易被空气氧化，导致鳕鱼肝油品质下降。因此，综合考虑各因素，确定酶解时间为2h。
2．2鳕鱼肝油生产工艺的响应面优化实验
2．2．1响应面实验设计及结果采用Box－BehnkenDesign模型实验设计原理，根据单因素实验结果，酶量、酶解温度和酶解pH三个因素对提取率有显著的影响，因此选择酶量、酶解温度和酶解pH为影响因素，采用三因素三水平的响应面分析方法，优化酶解法提取鳕鱼肝油工艺。实验方案与结果见表2。采用DesignExpert8．0．6软件，对数据进行处理。由表3可知，酶量和各因素平方项对鳕鱼肝油提取率的影响极显著(P＜0．01)，酶解pH和酶解温度对鳕鱼肝油提取率的影响显著(P＜0．05)，加酶量、酶解pH、酶解温度的交互作用对鳕鱼肝油提取率的影响均不显著(P＞0．05)。模型的确定系数r2=0．9921，表明模型相关度好。模型的调整确定系数(AdjR－Squared)r2=0．9779，表明模型能解释97．79%的效应值变化，实验误差较小。模型的失拟项P=0．8737＞0．05，表明模型稳定性较好。拟合回归方程为:Y=92．47+2．50A+1．37B+1．32C－0．15AB－0．83AC+0．89BC－16．95A2－3．08B2－4．47C2。在各因素水平范围内，由表3中F值的大小可以得出各因素对鳕鱼肝油提取率的影响程度依次为:酶量(A)＞酶解pH(B)＞酶解温度(C)。2．2．2响应面分析由图6可知，当温度为50℃时，pH对提取率的影响不显著，响应面曲线变化较平滑;加酶量对提取率的影响显著，响应面曲线变化较陡。由等高线图可见，等高线呈圆形且密度较小，说明加酶量与pH的交互作用对鳕鱼肝油提取率的影响不显著。由图7可见，在pH为6．5时，酶解温度对提取率的影响不显著，响应面曲线变化较平缓;加酶量对提取率的影响显著，响应面曲线变化较陡。由等高线图可见，等高线呈圆形且密度较小，说明酶解温度与加酶量的交互作用对提取率的影响不显著。由图8可以看出，当酶量为3250U/g时，酶解温度和pH对提取率的影响不显著，响应面曲线变化较平缓。由等高线图可见，等高线密度较小，说明酶解温度与pH的交互作用对鳕鱼肝油提取率的影响不显著。2．2．3验证实验通过响应面分析，得到最佳工艺条件，即加酶量3272．29U/g、pH6．62、温度50．83℃，在最佳工艺条件下，鳕鱼肝油的提取率可达到92．83%。考虑实际操作条件，确定最佳工艺参数为:加酶量3270U/g，pH6．5，温度50℃。在此条件下，进行3次重复实验，得到平均提取率为92．37%，预测值与实验值相对误差为0．49%，证明所建模型正确、可靠，能较好地预测鳕鱼肝油的提取率。
2．3酶解法与淡碱水解法所得鱼油的品质对比
由表4可以看出，酶解法鳕鱼肝油提取率及品质均优于传统淡碱水解法。酶解法鳕鱼肝油提取率达到93．44%，而淡碱水解法提取率仅为63．75%;酶解法所得鳕鱼肝油呈浅黄色、较澄清，品质较好，而淡碱水解法所得鳕鱼肝油呈棕红色、较混浊，分析原因为淡碱水解过程中温度过高，致使部分不饱和脂肪酸氧化，最终导致鳕鱼肝油品质下降。两种提取方法获得的鳕鱼肝油的酸价、碘价基本一致，但酶解法所得鳕鱼肝油的过氧化值低于淡碱水解法。表4淡碱水解法与酶解法所得鱼肝油的品质对比项目提取率/%颜色气味酸价/(mg/g)过氧化值/(meq/kg)碘价/(mg/100g)淡碱水解法63．75深棕红色、混浊有鱼肝油的腥味、有酸败味6．128．71142．5酶解法93．44浅黄色、较澄清有鱼肝油的腥味、无酸败味、无臭味5．497．49148．31。
3结论
本研究确定了鳕鱼肝油的最佳酶解提取工艺条件:加酶量3270U/g，pH6．5，温度50℃，料液比1∶1．5，酶解时间2h。在最佳提取工艺条件下，鳕鱼肝油的提取率可达到93．44%。对酶解法和淡碱水解法所得鳕鱼肝油进行比较，鳕鱼肝油的酸价、碘价基本一致，但酶解法所得鱼肝油的过氧化值较低、品质较好且提取率高。以木瓜蛋白酶提取鳕鱼肝油，具有提取条件温和、所得鳕鱼肝油品质较好、提取率高、对环境污染小等优势，符合现代水产加工业的发展要求。本研究为酶解法提取鳕鱼肝油的产业化应用提供了一定的理论指导。
作者：刘超 苗钧魁 刘小芳 王松 高华 冷凯良 单位：青岛大学医学院 中国水产科学研究院黄海水产研究所食品工程与营养研究室
