【关键词】自噬；肿瘤；溶酶体；细胞器；综述
自噬（autophagy）是真核细胞内的一种降解途径，能通过溶酶体使细胞内受损的细胞器及蛋白质等成分降解，广泛存在于人体的正常细胞和恶性肿瘤细胞中。自噬与恶性肿瘤的关系是近年生物医学领域的研究热点，多数研究采用不同的方法探讨二者的关系，而研究结论偏向于自噬在恶性肿瘤中起着促进与抑制的双重作用，但针对这些研究方法的文献综述较少。本文针对自噬在恶性肿瘤中常用的研究方法及其优缺点进行综述，以期为恶性肿瘤研究工作中自噬研究方法的选择及结果解释提供帮助。
1自噬与恶性肿瘤
自噬的概念最先由比利时科学家ChristiandeDuve提出，它是真核细胞内的一种降解途径，能通过溶酶体使细胞内受损的细胞器及蛋白质等成分降解。自噬性降解是机体内的一种病理生理过程，这一过程主要包括隔离膜（isolationmembrane）或吞噬泡（phagophore）的形成及延伸、自噬体（autophagosome）的形成、自噬体和溶酶体融合形成自噬溶酶体（autolysosome），最终胞内物质降解，产生的降解产物如氨基酸、脂肪酸等可被细胞再利用。自噬现象的出现是以实现细胞的稳态和细胞器的更新为目的，对细胞来说是一种有利的修复与防御机制。Meijer等[1]的研究表明，哺乳动物细胞有着基础的自噬来降解并回收损伤的细胞器及蛋白质，同时，自噬降解后的产物可为细胞提供生存所必需的能量。而Gozuacik等[2]的研究提出了一些恶性肿瘤的发生伴随有自噬水平的抑制。自噬与恶性肿瘤的关系吸引了众多研究人员的关注，成为国际学术界的研究热点。大量研究发现，自噬与恶性肿瘤的耐药、复发和转移相关[3]，而自噬相对恶性肿瘤的发生、发展来说是一把“双刃剑”[4]，既可起到促进的作用又可表现出抑制的效果。作者认为这除了与自噬本身的复杂性和其作用于恶性肿瘤的方式、途径及分子机制不尽相同相关外，还与研究自噬所采用的方法相关。
2自噬的人工干预和调节
正常情况下培养的细胞自噬活性很低，而一些恶性肿瘤的自噬水平又是受抑制的[2]。这不利于自噬现象的观察，对自噬进行人工干预和调节就显得很有必要。研究中常用工具药实现，有时根据研究目的，使用到一些遗传学技术，可以在基因的分子水平上对自噬进行干预。2.1工具药自噬的工具药可分为与自噬相关的抑制剂和诱导剂2种。常用的自噬抑制剂有3-甲基腺嘌呤（3-MA）[5]、巴弗洛霉素A1[6]及氯喹[7]，而常用的自噬诱导剂有西罗莫司、氯化锂[8]及构造营养缺乏的环境[9]。工具药可以根据不同的原理干预和调节自噬，例如，3-MA可抑制ClassⅢ磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）信号通路来抑制自噬体的形成，以此阻断自噬发生的步骤，而西罗莫司可抑制mTOR通路，以此诱导自噬活性增强。因此，工具药的选择应根据研究目的而定。2.2遗传学技术自噬的遗传学技术包括RNA干扰（RNAi）技术与近年发展起来的CRISPR-Cas9技术[10]（最新出现的一种由RNA指导的Cas9核酸酶对靶向基因进行编辑的技术）。RNAi是指利用与靶基因序列同源的双链RNA（dsRNA）可诱导特异性基因沉默的一种现象，因此RNAi技术可用于沉默或直接敲除目标基因的表达，同时具有较高特异性的特点，该技术目前普遍用于基因分子水平上的研究。通过RNAi技术沉默恶性肿瘤中与自噬相关的基因，观察自噬活性的变化，从而得出自噬与恶性肿瘤间的联系，可以为恶性肿瘤的靶向治疗提供新思路[11]。CRISPR-Cas9技术被称为接近目标基因组编辑的最终工具包，因其在基因组编辑中所体现出的超高的效率和简易的技术而吸引着众多科研工作者，同时被认为是在体细胞基因分子水平治疗上的一个新机遇[12]。Kim等[13]通过CRISPR-Cas9技术成功敲除自噬相关基因ATG5[14]，用以研究敲除ATG5后的黑色素瘤细胞中自噬抵抗BH3模拟棉酚所起的保护作用。CRISPR-Cas9技术开启了自噬与恶性肿瘤关系研究方法上的新篇章，而对于通过自噬相关分子及基因治疗恶性肿瘤，更是提供了无限的可能与巨大的探索空间。综上，遗传学技术相比工具药特异性更强，二者相互结合，可以更好地使研究者根据研究目的对自噬进行人工干预和调节。
3自噬的检测方法
自噬在体内是一个随时间不断变化的过程，自噬发生的步骤犹如一条“流水线”，先是隔离膜或吞噬泡的集结和延伸，接着自噬体形成，形成的自噬体与溶酶体融合，最后自噬性底物降解，产物就会被输送至细胞质中为细胞提供能量。为了保证细胞快速适应恶劣环境的变化，这一“流水线”的过程就会非常快，使自噬现象的检测比较困难。目前，自噬的检测方法主要基于这条“流水线”中的某一“时空点”或者某一“时空段”，相对自噬这一动态过程，这些检测方法本质上均是静态的。3.1基于“时空点”的检测该类检测常用的有透射电子显微镜、LC3免疫印迹及LC3单荧光检测，这些均基于自噬体的直接或间接检测原理。3.1.1透射电子显微镜透射电子显微镜主要通过观察自噬性结构[15]的形成及数量来判断自噬的发生，所观察的自噬性结构中最主要的是自噬体，因此是自噬体的直接检测方法[16]。透射电子显微镜检测结果的准确性基于观察者对自噬体在镜下结构的准确判断，这就不可避免地存在一定的主观性，同时，样本的制备也可影响观察者的判断。例如，脂质双分子层受制备过程所用试剂的影响而发生改变，影响对自噬体膜的判断，也可因不同切面自噬体数量不一而在推算整个细胞的自噬情况时结果出现误差。由此可见，透射电子显微镜探索自噬现象是基于形态学的观察，同样存在着不足的地方，使用时应结合其他检测来相互验证。3.1.2LC3免疫印迹LC3为自噬体膜上多功能标记蛋白[17]。自噬形成时，弥漫于细胞质中的LC3（即LC3-Ⅰ）与磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine，PE）偶联，转变成LC3-Ⅱ附着于自噬体膜上，当自噬体向溶酶体呈递后方才降解消失。因此，通过免疫印迹检测LC3-Ⅱ的表达或测定LC3-Ⅱ与LC3-Ⅰ比值可以从一定程度反映自噬体数量的多少[18]，这种检测即是基于自噬体间接的检测原理。这一方法的缺陷在于LC3抗体对LC3蛋白的2种类型亲和力不相同，对LC3-Ⅱ有更高的亲和力，因此会出现较高的假阳性率。3.1.3绿色荧光蛋白（GFP）-LC3单荧光检测该方法的检测原理也是基于LC3在自噬形成过程中与PE偶联并锚定于自噬体膜上的现象，利用GFP与LC3融合，根据荧光显微镜下绿色荧光斑点来示踪自噬形成[19]。自噬没有发生时，GFP-LC3融合蛋白弥漫分布于细胞质中，而当自噬发生之后，GFP-LC3融合蛋白就会集结且锚定在自噬体膜上，此时使用荧光显微镜即可观察到相对明显的绿色荧光斑点，而这些斑点代表的就是自噬体，再通过计数斑点数，就可以估测自噬体的数量。3.2基于“时空段”的检测该种检测有别于“时空点”检测。“时空点”检测得出的结果大多解释为自噬体数量的多少，而这可能由于自噬某一通路受阻使得自噬体数量多少与自噬活性强弱不相符[20]。“时空段”的检测包含了自噬形成的多个步骤及自噬降解过程的检测，因此可检测到自噬流（autophagicflux）[21]，这使得在形态学检测基础上进一步进行功能学检测成为可能，可在一定程度上得知自噬活性的强弱，但仍旧无法实时地监测自噬现象所发生的全部过程。“时空段”常见的检测方法有红色荧光蛋白（RFP）-GFP-LC3双荧光检测、LC3动态检测、长寿命蛋白降解检测。3.2.1RFP-GFP-LC3双荧光检测在GFP-LC3单荧光指示体系的基础上，增加RFP，利用GFP在酸性环境下其绿色荧光会发生淬灭而RFP对酸性环境不敏感及其红色荧光不会发生淬灭的原理进行自噬活性的检测[22]。结果判读时，通过显微镜成像后红绿荧光融合，融合后出现的黄色斑点即是自噬体，红色斑点是自噬溶酶体。因此，可通过计数不同颜色的斑点来反映自噬流的强弱。这种检测方法的缺点在于不能反映出自噬降解的过程，同时，溶酶体酶的活力及其pH值也可影响信号的检测。3.2.2LC3动态检测从自噬体形成、自噬体向溶酶体呈递，到自噬性底物降解，这些步骤的发生均伴随着LC3量的不断变化。通过LC3动态检测，即可将这个变化的过程反映出来，从而反映自噬活性的强弱。LC3动态检测所采用的技术手段有免疫印迹，也可通过流式细胞仪检测，也有研究通过加入一种溶酶体抑制剂来比较LC3-Ⅱ前后的差别，得出加入溶酶体抑制剂后LC3-Ⅱ表达增多的那部分，代表的即是被溶酶体所要降解的自噬体[23]。3.2.3长寿命蛋白降解检测哺乳动物体内蛋白质的降解可通过蛋白酶体ATP依赖的泛素降解和溶酶体ATP非依赖降解2种途径，蛋白酶体主要负责降解短寿命蛋白，而长寿命蛋白则主要通过溶酶体途径降解。根据溶酶体降解长寿命蛋白并在自噬诱导后与自噬体相融合的特性，将同位素标记法应用于细胞培养基，细胞合成的蛋白就会被同位素标记，而后把细胞转移至不含同位素的普通细胞培养基，使被标记的短寿命蛋白优先降解，随后开始自噬诱导，诱导后自噬活性增强，长寿命蛋白随之降解，此时测定上清液的放射活度，即反映出细胞经由自噬来降解底物的能力[24]。
4自噬在体内的研究方法
自噬在体内的研究方法已有先例，Mizushima[25]已成功构建GFP-LC3转基因小鼠，使得体内实时监控自噬成为可能。但目前有关自噬在体内的研究方法的文献不多，因此，使用GFP-LC3转基因小鼠进行体内自噬研究时，要结合体外自噬的检测方法，以避免单一方法的局限性。
5小结与展望
本文简单概述了自噬与恶性肿瘤的研究现状并列举了自噬的人工干预和调节方法、自噬的检测方法及自噬在体内的研究方法，这些方法普遍应用于恶性肿瘤中自噬现象的研究。遗憾的是，目前还没有一种方法可以准确可靠而特异地检测自噬，因此,自噬在恶性肿瘤中表现出的抑制与促进的双重作用也可能与自噬的研究方法使用不当相关。为了避免研究方法引起实验结果解释上的错误，就需要研究者理性地评估每一个研究结论。同时，自噬研究方法上的不足也为有志研究这一领域的科研工作者提供了巨大的探索空间，自噬与恶农业期刊性肿瘤关系的研究也有望为恶性肿瘤的临床治疗提供新靶点。
作者：张露 蒋梦彤 陈罡 李佳 单位：广西医科大学第一附属医院病理科
