１材料与方法
１．１材料
１．１．１菌株来源
４０株非重复铜绿假单胞菌分离自本院２０１２～２０１３年的尿液标本。质控菌株铜绿假单胞菌（ＡＴＣＣ２７８５３）由卫生部临床检验中心提供。
１．１．２培养基
Ｍ－Ｈ琼脂及肉汤培养基（Ｏｘｏｉｄ）购于重庆庞通医疗器械有限公司。
１．１．３抗菌药物
所有抗菌药物纸片为英国Ｏｘｏｉｄ产品；磷霉素、６－磷酸葡萄糖购于Ｓｉｇｍａ公司；亚胺培南（ＵＳＰ标准物质）、左氧氟沙星（ＬＥＶ）、环丙沙星（ＣＩＰ）、庆大霉素（ＧＥＮ）为中国药品生物制品检定所产品。１．１．４仪器ＶＩＴＥＫ－２ＣＯＭＰＡＣＴ全自动微生物分析系统和ＡＴＢ微生物检测系统购于法国生物梅里埃公司。
１．２方法
１．２．１细菌培养和鉴定
细菌培养和鉴定按照《全国临床检验操作规程》的常规技术操作及ＡＰＩ细菌生化鉴定条件进行鉴定，鉴定系统为法国生物梅里埃公司ＡＰＩ和ＶＩＴＥＫ－２系统。
１．２．２药敏试验
药敏采用Ｋ－Ｂ纸片扩散法测抑菌圈直径，用ＶＩＴＥＫ－２测最低抑菌浓度（ＭＩＣ）。磷霉素、亚胺培南、头孢他啶、左氧氟沙星和庆大霉素药敏试验采用琼脂平板倍比稀释法。药敏结果判定依据美国临床实验室标准化委员会（ＣＬＳＩ）２０１３年标准。
１．２．３药物协同试验
磷霉素、亚胺培南、头孢他啶、左氧氟沙星和庆大霉素分别以灭菌ＭＨ肉汤稀释，使抗菌药物的浓度分别为８×ＭＩＣ、４×ＭＩＣ、２×ＭＩＣ、１×ＭＩＣ、１／２×ＭＩＣ、１／４×ＭＩＣ、１／８×ＭＩＣ。将配好的不同浓度的两种协同作用药物按棋盘法设计，两两组合加入９６孔无菌微孔板中，每种抗菌药物取５０μＬ分别排列在９６孔板的行与列上，然后再将浓度为１×１０６ＣＦＵ／ｍＬ的菌液１００μＬ加入孔中，３７℃培养过夜。结果判断以完全无细菌生长的最低药物浓度为ＭＩＣ。
１．２．４部分抑菌浓度指数（ＦＩＣＩ）指数计算与判读标准采用ＦＩＣＩ分析药物的协同作用：ＦＩＣＩ＝Ａ药联合时的ＭＩＣ／Ａ药单用时的ＭＩＣ＋Ｂ药联合时的ＭＩＣ／Ｂ药单用时的ＭＩＣ。判定标准：ＦＩＣＩ≤０．５为协同作用；０．５＜ＦＩＣＩ≤１为相加作用；１＜ＦＩＣＩ≤２为无关作用；ＦＩＣＩ＞２为拮抗作用。
２结果
２．１临床分离铜绿假单胞菌的药物敏感性４０株铜绿假单胞菌对亚胺培南等１５种药敏纸片的药敏结果如表１所示。除抗菌药物阿米卡星、环丙沙星、头孢哌酮／舒巴坦、头孢他啶和妥布霉素的耐药率低于３０％，对其他抗菌药物均具有较高的耐药性。此外，亚胺培南耐药的铜绿假单胞菌与亚胺培南敏感的菌株相比，对抗菌药物具有更高的耐药性。
２．２联合抑菌试验尿液分离的铜绿假单胞菌对磷霉素的耐药率为３７．５％，亚胺培南耐药和铜绿假单胞菌对磷霉素的敏感性差异无统计学意义（Ｐ＞０．０５）。磷霉素与４种抗菌药物分别联合应用对４０株铜绿假单胞菌的体外抗菌活性如表２所示。结果表明，磷霉素与４种抗菌药物联合应用，对铜绿假单胞菌多数呈相加和无关作用，协同作用较少，未见拮抗作用。
３讨论
尿路感染是临床常见的感染性疾病之一，革兰阴性菌是尿路感染的主要病原菌。而今年来，由于广谱抗菌药物的广泛应用及复杂尿路感染患者的增多，铜绿假单胞菌的分离率逐年增高，同时铜绿假单胞菌的耐药性给临床治疗带来很大的困难。本研究发现临床分离铜绿假单胞菌具有较高的耐药性，尿液分离的铜绿假单胞菌对磷霉素的耐药率高达３７．５％，比国内外的报道略高［２－３］。革兰阳性菌和革兰阴性菌都具有细胞壁结构，细胞壁的主要成分是肽聚糖，在细胞壁合成的初期，需要磷酸烯醇丙酮酸参与合成二磷酸尿嘧啶－Ｎ－乙酰葡糖胺丙酮酸盐［４］，磷霉素作为一种较早发现的天然抗菌药物，其分子结构与磷酸烯醇丙酮酸结构相似，其与细菌竞争同一转移酶，使细菌的细胞壁合成受到阻碍从而导致细菌死亡，因此对革兰阳性菌和革兰阴性菌都具有较强的抗菌作用［５］。有研究显示，亚胺培南耐药菌株对其他抗菌药物均具有较高的耐药性，提示针对亚胺培南耐药菌株应根据药敏结果选择抗菌药物。磷霉素对铜绿假单胞菌具有较高的敏感性，并且亚胺培南耐药和敏感的菌株对磷霉素的药物敏感性无明显差异，说明对于多重耐药铜绿假单胞菌，磷霉素依然是一个可供选择的抗菌药物。国外研究发现磷霉素对铜绿假单胞菌具有较好的抗菌活性，而国内研究发现磷霉素对铜绿假单胞菌具有较高的耐药性，有研究显示铜绿假单胞菌的耐药率高达７１％［４］，本院铜绿假单胞菌对磷霉素具有较高的敏感性可能是因为本院临床上已经有５年未使用磷霉素。在本研究中，磷霉素与其他４种抗菌药物联合应用只对少部分菌株具有协同作用，而对大部分菌株只有相加和无关作用。协同作用比例远低于国内外的报道［６－７］，部分研究报道庆大霉素与磷霉素协同作用可达到８０％［８］。此研究差异可能是由于不同地区流行的菌株类型不同。磷霉素是广谱抗菌药物，虽然本研究显示磷霉素与其他抗菌药物联用只对少部分铜绿假单胞菌具有协同作用，但是磷霉素单独使用对铜绿假单胞菌仍具有较高的抗菌活性，并且对泌尿系统常见的肠杆菌科细菌具有较高的活性并与其它抗菌药物具有协同作用［９］，因此磷霉素是治疗泌尿系统感染的药物之一。
作者：黄正谷 苏世芳 单位：重庆市公共卫生医疗救治中心检验科
