1材料与方法
1.1主要试剂和仪器
人宫颈癌细胞株Hela由北京大学肿瘤防治研究所惠赠。ＲPMI1640培养基(Gibco公司)，胎牛血清(天津市川页生化制品有限公司)，CCK-8(上海同仁化学)，碘化丙啶(PI)深圳晶美生物工程有限公司产品;FITC-p53、PE-bcl-2(美国BD公司)。美国SpectraMaxM2e多功能微孔板检测系统，美国FACSAria流式细胞仪，日本HITACHIS-3400N扫描电镜。
1.2Hela细胞培养
细胞用含10%胎牛血清的ＲPMI1640培养基，37℃、5%CO2条件下培养。取对数生长期细胞用不同浓度没食子酸处理。
1.3CCK-8法检测细胞增殖抑制
取对数生长期的Hela细胞5×104/ml接种于96孔培养板，100μl/孔。用ＲPMI1640培养液将没食子酸稀释成7个不同浓度(0.02，0.04，0.08，0.16，0.32，0.64，1.28mg/L)，分别加入96孔培养板(100μl/孔)，每组设4个复孔，对照组加入等体积培养液，置37℃、5%CO2培养24h。然后每孔加入CCK-820μl继续培养4h，之后用SpectraMaxM2/M2e多功能微孔板检测系统测吸光度(A490nm值)，按公式计算细胞抑制率;抑制率(%)=(1－实验组平均A490nm值/对照组平均A490nm值)×100%。
1.4流式细胞仪检测
p53，bcl-2蛋白表达取对数生长期Hela细胞(密度为1×106/ml)分别接种于4个50ml的培养瓶中，贴壁后换不同浓度的没食子酸培养液(0.08、0.16、0.32ng/L)，对照组加入等量培养液，培养24h后，收集细胞，分别加入20μlFITC-p53及PE-bcl-2孵育20min，上流式细胞仪检测。
1.5扫描电镜观察
将盖玻片高压处理后放于六孔板中，取对数生长期Hela细胞(密度为1×106/ml)分别接种到6孔板，使细胞贴附于盖玻片上，再用不同浓度的没食子酸作用，使用扫描电镜观察形态。
1.6统计学处理
采用SPSS11.0软件进行t检验。
2结果
2.1没食子酸对Hela细胞增殖的影响CCK-8法检测
0.02，0.04，0.08，0.16，0.32，0.64，1.28mg/L7个不同浓度的没食子酸作用Hela细胞24h，对Hela细胞的生长均得到明显的抑制，并且随着药物浓度增加，对Hela细胞抑制率增加且生存率下降。
2.2没食子酸对Hela细胞p53和bcl-2表达的影响
经0.16，0.32，0.64mg/L3个不同浓度的没食子酸作用Hela细胞24h后，与对照组相比，p53表达明显增高，bcl-2表达显著降低，用药前后均有显著差异，且没食子酸对Hela细胞的作用呈剂量依赖性。
2.3没食子酸对Hela细胞形态的影响经
0.32，0.640mg/L2个不同浓度的没食子酸作用Hela细胞24h后，与对照组相比，细胞形态出现明显变化，细胞间连接中断，外形皱缩，表面塌陷，形成凋亡小体。
3讨论
没食子酸作为一种有机酸类，易被消化道所吸收，其作用机制已较明确，因其对肝脏、肾脏、心血管有较强的亲和力，生物学效应比较广泛〔5，6〕，没食子酸还具有抗氧化作用〔7，8〕。选择毒副作用低或无毒副作用的肿瘤药物治疗策略，是临床不断探索的难题〔9〕。细胞凋亡是细胞在一定的生理或病理条件下，遵循自身的程序，自己结束生命的过程，最后细胞脱落离体或裂解为若干凋亡小体，被其他细胞吞噬，并且在形态上有一定特征〔10，11〕。中药抗肿瘤作用的最重要机制之一是诱导肿瘤细胞的凋亡，从而抑制肿瘤的进一步恶化，乃至全部消灭残留的肿瘤细胞〔12〕。bcl-2蛋白家族是细胞凋亡相关基因研究中研究得最多的一类蛋白质〔13〕。p53基因对细胞凋亡的调控是研究得较多的〔14〕。p53基因对防止细胞增生和保持DNA受损基因组的完整性有重要作用〔15〕。应用转基因方法研究发现:定位于内质网膜上的bcl-2可能通过阻断钙离子Ca2+从内质网向胞质中的流动，使依赖Ca2+的核酸内切酶活性降低，从而阻断细胞凋亡〔16〕。有学者认为bcl-2通过抗氧化剂或抑制氧自由基的产生而发挥其抑制细胞凋亡的功能〔17〕。p53调控一些仅有BH3区域的蛋白，作为Bax/Bak的上游调控机制，诱导细胞凋亡〔18，19〕。流式细胞术结果表明没食子酸具有上调抑癌基因p53的表达，下调癌基因bcl-2的表达作用，而诱发Hela细胞凋亡。
作者：罗强 任鸿 孙黎 郭春燕 单位：河北北方学院生命科学研究中心
