1GJ的结构、功能与调节
1.1GJ的结构
GJ由位于相邻细胞膜上的2个连接子(connexons)或称半通道(hemichannel)对接而成,每个连接子是由6个位于细胞膜上的连接蛋白(connexin,Cx)构成。所有的连接蛋白都具有4个琢螺旋形成的跨膜结构域(Ml~M4)、一个胞内环(CL)和两个胞外环(E1~E2)。连接蛋白的氨基端和羧基端位于细胞质内。其中氨基端、4个跨膜区和2个胞外环属于高度保守区域,具有稳定蛋白质结构和位置的功能,并允许各成员之间的相互识别和作用;而羧基端和胞内环部分则具有差异性,决定不同连接蛋白的生物学特性[2]。自1996年首个连接蛋白基因被克隆后,至今发现的Cx基因在小鼠有20种,在人类有21种,其中19种为同源物(除外小鼠的mCx33、人类的hCx25和hCx59)。连接蛋白家族成员按分子量命名,如Cx26(26kD)、Cx32(32kD)、Cx37(37kD)、Cx43(43kD)等[3]。其中Cx43在机体大多数组织和细胞中均有表达,因此对其功能及作用机制研究较多[4]。
1.2GJ的功能
作为细胞间直接的物质信息交换通道,GJ允许离子及相对分子量小于1.5kD的小分子自由通过,如Na+、水分子、葡萄糖、核苷酸、氨基酸、第二信使(Ca2+、cAMP、cGMP)等[5-6]。GJIC对维持细胞稳态、调控细胞生长和分化起着重要的作用[7],其发挥功能主要通过电耦联和代谢耦联两种方式。
1.3GJIC的调节
GJIC的调节既可通过改变Cx的表达而被慢性调节,也可通过改变GJIC的传导速度或GJ的开闭而被急性调节。前者主要表现在对CxmRNA的翻译、转录及Cx的合成、转运、装配等方面进行调节。GJ的开闭受多种因素的影响,如胞内pH值、胞内Ca2+浓度、磷酸化状态及一些神经体液因子和蛋白质调节因子等。连接蛋白羧基端的磷酸化调节是影响GJ的一个重要因素。连接蛋白的磷酸化调节主要通过蛋白激酶(包括PKA、PKC、CK、MAPK、非受体酪氨酸激酶)和蛋白磷酸酶共同完成[8]。不同的连接蛋白在不同刺激因子作用下,导致连接蛋白分子中不同的氨基酸位点磷酸化/去磷酸化,从而产生不同的生理效应。大多数磷酸化过程可使GJIC功能下降:如PKC通过使Cx43的S368位点磷酸化,而致GJIC功能下降;MAPK则通过使Cx43的S279和S282位点磷酸化,降低通道开放的频率从而抑制其通讯功能。但有研究报道,磷酸化过程可使GJIC功能升高:如PKA通过使Cx43的S364、S365、S369及S373位点磷酸化而致GJIC功能升高。
2GJ在女性生育的研究
2.1子宫内膜容受性
子宫内膜在产生月经及胚胎着床过程中起着至关重要的作用。子宫内膜GJIC功能的变化可直接影响种植窗子宫内膜的容受性,从而影响胚胎着床过程。Jahn等[9]对正常女性月经周期各时段的子宫内膜Cx43表达进行检测后发现,随着卵泡的发育,雌激素水平上升,连接蛋白的表达逐渐增加,至月经中期卵巢排卵后,孕激素水平急剧上升,连接蛋白的表达则逐渐减少,直至月经来潮前完全消失。这表明子宫内膜Cx的表达量受雌激素及孕激素的影响。雌激素可上调Cx的表达,而孕激素的作用则相反。据此推测,受精后孕激素水平升高,子宫内膜Cx表达下降,细胞间连接松散,因此利于胚胎着床[10]。在辅助生育技术中,需使用促排卵药物获得多个卵细胞。但有研究指出,促排卵药物的应用会影响子宫内膜的容受性,不利于胚胎着床,导致临床妊娠率降低[11],其影响机制尚不明确。有学者检测超促排卵后小鼠子宫内膜连接蛋白的表达,发现超促排卵组Cx43的表达明显高于对照组,因此推断超促排卵可能导致连接蛋白的异常升高从而降低了子宫内膜容受性。
2.2分娩发动
缝隙连接广泛分布于子宫平滑肌细胞之间,通过调控平滑肌细胞内信号通路,影响子宫收缩的协调性和节律性。因此,对子宫平滑肌中Cx43进行研究有助于了解分娩发动时子宫收缩的分子学机制,对预防早产及宫缩乏力性产后出血有重要意义。近年国内外学者发现两者之间存在密切关系[12]。子宫平滑肌细胞之间表达最丰富的是Cx43和Cx45。电生理研究发现,Cx43形成的缝隙连接通道为子宫平滑肌细胞收缩提供了低电阻通道,使离子能迅速通过,保证了子宫平滑肌收缩的协调性。分娩发动前的几天,孕鼠子宫平滑肌细胞Cx43开始大量合成并储存在高尔基囊泡内,直到分娩发动时,Cx43才迅速转运到细胞膜上并装配成缝隙连接。Tabb等[13]研究发现,早产及足月分娩时都有Cx43的增加,而在未孕妇女中子宫肌细胞中则无明显表达。Sheldon等[14]研究表明,子宫肌细胞的兴奋性和Cx45的表达密切相关,Cx45与Cx43的比值愈高,平滑肌细胞的兴奋性愈低。
2.3GJ与卵泡发育
卵泡是由卵母细胞、周围的卵丘细胞、颗粒细胞及卵泡膜细胞组成。卵泡膜细胞是卵泡中唯一可与卵巢内毛细血管接触的部分。卵母细胞则处于无血管的微环境中,其生长所需的营养物质及信号调控则需通过卵母细胞与其周围体细胞之间的缝隙连接进行交换[15]。研究显示,缝隙连接中Cx43及Cx37与卵泡发育密切相关[16]。
2.3.1GJ在卵巢中的分布
在卵泡发育的不同阶段,Cx的表达及功能具有阶段特异性[17]。连接蛋白在原始卵泡上几乎不表达或表达量非常少,初级卵泡开始表达,逐渐增加至排卵前卵泡时表达最丰富,排卵后迅速下降[18]。可见随着卵泡的发育,连接蛋白的表达也增加。这可能是由于在卵泡的生长过程中,颗粒细胞层数增加,卵母细胞与富含血管的卵泡膜细胞间的距离增大,因而要求有更高效的细胞间联系促进卵母细胞成熟所需的物质和能量供给。研究发现,卵巢组织中存在着多种连接蛋白,如Cx43、Cx37、Cx45、Cx32、Cx26等[19-20],其中Cx43主要表达于颗粒细胞上,Cx37主要表达于卵母细胞上,Cx32和Cx26则主要表达于卵泡膜细胞上。
2.3.2卵泡中GJ的调控因素
研究发现,在卵泡发育的不同阶段,缝隙连接蛋白的调控因素并不一致。在卵泡发育的早期,连接蛋白及其基因是受到发育过程本身调控的,而在卵泡腔形成后,则通过Gn来调控连接蛋白的转录、翻译及翻译后修饰的[21-22]。FSH可通过作用于PKA引起大鼠颗粒细胞Cx43羧基端的S365、S368、S369、S373等位点的磷酸化,增强GJIC的形成及功能。而LH可从3个方面调控GJ:(1)通过PKA和ERK1/2信号通路抑制Cx43的翻译,减少GJ的表达;(2)作用于MAPK抑制连接蛋白的磷酸化,抑制GJIC的功能;(3)使卵丘颗粒细胞的细胞膜发生去极化,细胞内钙离子浓度升高,升高的钙离子通过缝隙连接进入卵母细胞,使卵母细胞发生去极化并引起细胞钙离子浓度的瞬时升高,抑制GJIC的功能[23]。此外,有研究指出,骨形成蛋白15,4,7(bonemorphogeneticprotein,BMP)可下调Cx43的表达,降低GJIC[24-25]。作为甾体激素的一种,雄激素对卵泡中缝隙连接蛋白的表达起着重要的调控作用。Wu等[26]研究发现,过高的雄激素会降低颗粒细胞中Cx43表达,推测这可能是多囊卵巢综合征(polycysticovariansyndrome,PCOS)发生卵泡形成及排卵障碍的原因之一。但Talhouk等[27]的研究结果与之相反:通过注射雄烯二酮制造的大鼠PCOS模型中,卵泡中的Cx43表达量高于正常对照组;颗粒细胞体外培养试验中,Cx43的表达量及产生的孕酮随着添加雄烯二酮浓度的增加而升高。因此,雄激素对卵泡中缝隙连接蛋白的影响以及作用机制,还需进一步研究。
2.3.3GJ在卵泡发育过程中的作用
在卵泡发育过程中,缝隙连接在原始生殖细胞迁移、卵母细胞减数分裂能力恢复、颗粒细胞增殖、排卵及黄体形成过程中起着重要的调节作用。(1)GJ在原始生殖细胞迁移过程中的作用:发育生物学超微实验发现,胚胎发育囊胚期阶段就有Cx43的表达。Juneja等[28]研究发现,Cx43基因敲除小鼠表现为生殖细胞严重缺失,这种缺失可追溯到妊娠后的11.5天,此时原始生殖细胞开始向生殖嵴迁移。性腺中的生殖细胞数明显减少,只有正常生殖细胞数的10%。这表明Cx43基因敲除小鼠原始生殖细胞迁移过程出现问题,导致原始生殖细胞受损。(2)GJ在减数分裂恢复过程中的作用:卵泡的发育除了形态学上的变化,还涉及细胞分化的过程。小鼠卵母细胞在有腔卵泡阶段就已获得了恢复减数分裂成熟至M域期的能力,但由于颗粒细胞通过缝隙连接持续低水平发送cAMP、cGMP信号至卵母细胞,从而保持卵母细胞阻滞于减数分裂双线期,直至LH峰出现导致卵泡内细胞间GJIC的破坏,卵母细胞中的cAMP、cGMP水平降低,卵母细胞才恢复减数分裂能力[29-30]。(3)GJ在卵泡生长过程中的作用:卵母细胞处于无血管的微环境中,其生长所需的营养物质均需通过卵母细胞与其周围体细胞之间的缝隙连接进行交换[15]。因此,缝隙连接参与了卵泡生长的整个过程。Cx43基因敲除小鼠的卵泡发育受阻,多在颗粒细胞形成多层结构之前发育就停止了,卵母细胞和颗粒细胞都出现不同程度的空泡化,透明带发育不良,卵母细胞不能恢复成熟分裂[31]。这主要是因Cx43缺失导致颗粒细胞间联系消失,继而导致颗粒细胞增殖和分层失败。因此,Cx43对于保证颗粒细胞的正常增殖和分层,维持卵泡正常的发育和结构至关重要。(4)GJ与卵泡闭锁:卵泡闭锁是凋亡因子和抗凋亡因子高度协调的一个凋亡过程,在卵泡生长、发育过程中,约99%的卵泡都会选择性消失,卵泡的闭锁主要源于颗粒细胞的凋亡。研究发现,Cx43表达与颗粒细胞的凋亡指数呈负相关,Cx43基因敲除小鼠卵巢内卵母细胞数下降,并伴随着原始生殖细胞凋亡数的增加[32]。(5)GJ在排卵及黄体形成及发育中的作用:黄体细胞由颗粒细胞与卵泡膜细胞转化而来。Simon等[33]研究发现,Cx37基因剔除的小鼠颗粒细胞提前分化为黄体细胞,形成黄体结构,表明卵母细胞与颗粒细胞间有某种抑制信号可通过缝隙连接传递,以阻止颗粒细胞转化成黄体细胞。
综上,缝隙连接在全身器官、组织及细胞中广泛存在,在细胞增殖分化、生长发育及维持内环境稳定等方面起着十分重要的作用。随着研究的深入,缝隙连接在女性生育,尤其是卵泡发育方面的重要作用也日显明确;但其具体作用机制及调节机制尚未清楚,且存有争议,需进一步的研究。
作者：张阳阳 徐阳 单位：北京大学第一医院生殖与遗传医疗中心
