1α-溶血素分泌途径的胞外转运机制
1.1α-溶血素分泌途径的组成元件
将α-溶血素转运至胞外的途径俗称α-溶血素分泌途径，属于革兰氏阴性菌的Ⅰ型分泌途径［8］。大肠杆菌α-溶血素分泌途径涉及3个组分:HlyB、HlyD、TolC。HlyB属于ATP结合蛋白(ATP-bindingcassette，ABC)家族，位于大肠杆菌细胞膜内膜上，为该途径特异性组成成分，它含有2个重要的结构:①N末端的由6个α-螺旋跨膜片段组成的跨膜区(transmembranedomain，TMD)，该结构与蛋白识别有关［13－14］;②C末端的核苷酸结合域(nucleotidebindingdomain，NBD)，转运时，与ATP水解相偶联［15－16］。HlyD属于膜融合蛋白(membranefusionprotein，MFP)，也是该途径特异性通道蛋白，含有两个重要的区域:区域A和区域B。区域A处于HlyD的C末端，由33个氨基酸组成1个螺旋-环-螺旋的结构。研究表明，Leu475、Glu477和Arg478对于HlyD的功能有着至关重要的作用，其中最后1个精氨酸(Arg478)可能与α-溶血素的释放有关;对于区域B，位置为127到170位氨基酸残基，与外膜蛋白TolC高度同源，转运时，与TolC结合形成转运通道［17－18］。TolC属于多系统通用外膜蛋白(outermembraneprotein，OMP)，以三聚体的形式，通过β-桶(β-barrel)结合于外膜上，在周质空间的部分组成了长为10nm、直径为3.5nm的α-螺旋形的管状［19］。除α-溶血素之外，TolC还参与抗菌素、重金属离子、有机溶剂等小分子物质的转运［20］。
1.2α-溶血素分泌途径的信号肽
与II型分泌途径不同，α-溶血素分泌途径中的信号肽(HlyAs)位于α-溶血素的C端，由60个左右的氨基酸残基组成。通过定点突变、圆二色谱、核磁共振等技术研究表明，信号肽中含有一段保守序列，组成螺旋-接头-螺旋的二级结构，其中两亲的螺旋和接头结构在信号肽的识别中具有至关重要的作用，而第2个螺旋结构对转运过程没有明显的作用［21－22］。转运过程结束后，信号肽不会被切除［23］。
1.3α-溶血素分泌途径介导蛋白胞外分泌的过程
HlyB和HlyD一般以稳定的内膜复合物形式存在，当α-溶血素C末端信号肽与HlyB-D复合物结合后，可诱导HlyD三聚体与TolC接触，形成桶状复合物，HlyD的螺旋卷曲结构与TolC作用，使TolC在周质空间末端的螺旋卷曲结构松开，从而打开连接内外膜的跨膜转运通道，目的蛋白自C-末端开始穿过通道从HlyB-D转移到TolC，进而分泌至胞外。当α-溶血素分泌至胞外后，转运蛋白即恢复到原始状态(图1)［4，8］。在转运过程中，除HlyB中的核苷酸结合域水解ATP供能以外，质子推动力(protonmotiveforce，PMF)也可以提供部分能耗，并且在转运起始阶段起着关键性的协助作用。研究表明，其他外源蛋白在C末端融合α-溶血素的信号肽(HlyAs)时也可以通过该途径实现胞外分泌表达［8］。
1.4α-溶血素分泌途径转运蛋白后的折叠过程
在蛋白折叠方面，过去几十年也取得了一定的进展。研究发现，在转运过程中，目的蛋白是以未折叠的形式转运的［25］，之后目的蛋白的折叠可能由其C末端区域诱发或者细胞表面的脂多糖可能提供了一个有利于蛋白折叠的环境［26］。在对溶血素的相关研究中，发现膜融合蛋白HlyD的完整性直接或间接地影响了转运过程中或之后HlyA的折叠［27］。此外，此过程虽然不经历周质空间步骤，同样可以实现含有二硫键蛋白的胞外分泌表达，研究资料显示分泌蛋白中的二硫键可能是在转运通道或胞外形成的，与二硫键(disulfidebond，Dsb)形成伴侣家族无关［28］。然而，迄今为止，还没有关于二硫键形成及蛋白折叠具体过程的报道。
2采用α-溶血素分泌途径进行重组
蛋白的胞外分泌表达随着对α-溶血素分泌途径研究的不断深入，人们发现其在分泌外源蛋白方面的优势越显突出:①分泌方式为“一步跨两膜”，没有周质空间的积累;②可分泌的蛋白分子量范围很广(50－4000氨基酸)［4，8］;③具有基质分泌的传统优势。因此，20世纪90年代起，国内外学者已开始尝试利用该途径进行重组蛋白的分泌表达。然而，由于对α-溶血素分泌途径目前只发现存在于能引起人泌尿道感染的大肠杆菌中，而且目的蛋白被α-溶血素分泌途径通道蛋白识别及转运需要其C末端具有该途径特征性信号肽，因此人们在采用该途径分泌外源蛋白时，需要共表达特异性转运蛋白HlyB和HlyD，目标蛋白的C末端需要融合α-溶血素的信号序列。
2.1医学方面
关于α-溶血素途径分泌重组蛋白目前主要集中在免疫学和疫苗中的应用，其中，最重要的是用于呈递活体细菌疫苗中的异源抗原［29－33］。已有研究表明，减毒的活体细菌疫苗是异源抗原良好的承载体，相比其他分泌途径，α-溶血素分泌途径对异源抗原大小没有限制，可把其从胞内直接分泌至胞外，刺激宿主的免疫系统产生免疫效应，从而克服了靠细胞裂解发挥作用的局限性［8］。例如:1996年，GentschevI等将李斯特菌素基因在减毒沙门氏菌中进行了分泌表达，在小鼠中取得了有效的保护性免疫效果［31］;2005年，他们又将HlyA操纵子连接至载体pMOhly，再与C-raf家族中丝氨酸-苏氨酸激酶基因连接，转化至减毒沙门氏宿主菌中，胞外蛋白表达量达到2－3μg/mL，在含肿瘤的野生型小鼠体内产生了特异性的C-Raf抗体和T细胞反应，更重要的是，此疫苗可以减弱肿瘤的增长［32］。
2.2酶制剂方面
相对于免疫学方面的应用，α-溶血素分泌途径在酶制剂表达方面的研究相对较少。工业酶通过大肠杆菌I型途径分泌必须以非致病性大肠杆菌作为宿主菌，目前这些研究中的目标蛋白多为蛋白酶和酯键水解酶类［13，34－36］。例如，2009年，NarayananN等成功地采用α-溶血素途径将南极假丝酵母脂肪酶酶B进行了胞外可溶性表达，解决了胞内和周质表达存在的错误折叠、不稳定等问题，且得到了比采用大肠杆菌其它分泌系统更好的胞外表达效果，同时对细胞生理未产生明显的影响［35］。本研究团队在前期工作中成功地采用α-溶血素途径进行了角质酶的高效分泌型表达，其胞外产酶量达到了II型途径分泌量的2.5倍［37］。这些成功的事例预示着大肠杆菌I型分泌途径在工业酶研制中的应用范围将可能进一步拓宽。需要指出的是，由于信号序列在转运结束后不切除，因此需要考虑信号肽是否会对蛋白的生物活性产生不利影响。若无影响可不切除，否则可通过以下2种方式切除信号肽获取天然成熟蛋白:1，在目标蛋白和信号肽之间插入外膜蛋白酶(outermembraneproteinT，ompT)特异性切割位点，在蛋白跨越外膜时将信号肽切除;2，在目标蛋白和信号肽之间插入具有位点特异性的蛋白酶(如烟草蚀纹病毒蛋白酶)识别序列，在蛋白分泌后采用特定的蛋白酶将信号肽切除。
3采用α-溶血素分泌途径分泌外源重组蛋白的效能强化
由于大肠杆菌自身的蛋白分泌能力较低，因此在提高外源蛋白的胞外生产水平时，强化分泌过程尤为重要。针对α-溶血素途径分泌重组蛋白，目前主要集中在转运元件的改造和重组目标蛋白的改造两方面。
3.1转运元件的改造
尽管目前关于α-溶血素分泌途径的转运元件中涉及蛋白识别和转运的关键区域研究较多且较为清晰，但对于如何强化其胞外转运能力的报道很少，且均为特异性转运蛋白HlyB和HlyD的定向改造。2005年，Sugamata等对转运蛋白HlyB/D进行突变，得到了能够使模型蛋白枯草杆菌蛋白酶E胞外分泌量提高27和15倍的突变体，经分析其关键突变位点分别为HlyB中的L448F和HlyD中的G654S［34］，但对不同模型蛋白的分泌增强效应不尽相同，且与培养温度有关，其机理规律还在探索之中。2010年，Low等以环糊精葡萄糖基转移酶作为报告蛋白，通过对HlyAs61、HlyB和HlyD进行改造，通过筛选得到了5株比原始分泌量提高35%－217%的突变体，并且突变位点均位于HlyB的跨膜结构区，揭示了该区域对于提高分泌水平的重要性，并且在角质酶的分泌表达中得到了验证［13］。
3.2重组蛋白的折叠速率
提高目标蛋白的胞外分泌水平不仅与分泌系统的转运效能有关，目标蛋白的性质也是重要因素之一。研究表明，目标蛋白的折叠速率对于其通过α-溶血素途径转运的效率具有重要的影响。Bakkes等研究者选择麦芽糖结合蛋白(MalE)为模型蛋白，通过研究影响其折叠速率的几种突变体的分泌表达情况，表明降低折叠速率可以提高分泌效率［38］。由于上述模型蛋白为细菌来源的且天然为分泌型蛋白，为进一步研究该理论的普遍适用性，Schwarz等选取了哺乳动物老鼠来源的细胞浆的肠脂肪酸结合蛋白作为研究对象，表明其野生型不能通过α-溶血素途径分泌，而低折叠速率的突变体则可通过α-溶血素途径分泌至胞外，并且得到了正确折叠的、具有生物活性的目标蛋白［39］，该项报道表明重组蛋白本身在其分泌型表达时亦有可能起着决定性作用，对进一步揭示该途径的转运机制和其实际应用均具有非常重要的指导意义。
4展望
大肠杆菌是大多数科学研究中表达重组蛋白的首选宿主菌，然而，薄弱的蛋白分泌能力在一定程度上限制了其大规模应用。重组蛋白的胞外分泌表达是一项涉及分子机理和实际经验的工作，目前人们已经开发了多种强化蛋白分泌过程的方法，但达到工业化生产规模的较少，该技术进一步的发展还需依赖对转运机制的深入研究。大肠杆菌的α-溶血素分泌途径具有组成元件简单、一步跨两膜的独特优势，虽然相对于II型分泌系统，报道较少，但已对于其分泌机制及其应用有了较为广泛的研究。我们认为今后将着重向以下2个方向发展:①研究蛋白转运过程中通道蛋白之间以及通道蛋白与目标蛋白之间相互作用的关键位点及其动态反应过程，同时也为理性设计提高该途径的分泌效能提供理论依据;②通过不同目标蛋白分泌水平的报道以及我们的实验积累发现，该途径应用局限的主要原因有可能是存在底物特异性，即不同蛋白能否分泌或分泌量差别较大，因此探究该途径所能转运的底物特征及规律，有助于深入了解该途径分泌机制，也能够为拓宽其实际应用提供更明确的指导广西职称。相信随着科学研究的不断深入，α-溶血素分泌途径的分子机制越来越清晰，实际应用也会越来越广泛。
作者：宿玲恰 陈晟 吴敬 单位：江南大学 食品科学与技术国家重点实验室 生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室
