1统计学分析
采用SPSS17.0统计软件进行统计学分析．各项数据以Mean±SD表示，实验组与对照组样本间的差异比较采用配对样本t检验，*P＜0.05，＊＊P＜0.01，＊＊＊P＜0.001，表示差异有统计学显著性意义．
2结果
2.1TBL的分离纯化
采用盐析，HiTrapDEAEFF离子交换柱层析和SuperdexTMG-75，10/300凝胶柱层析分离．获得的TBL在SDS-PAGE上显示单一条带(Fig．1，泳道2)，蛋白质纯品达到95%以上，分子质量约62kD．
2.2TBL对细胞增殖的影响
采用不同浓度的TBL(0、5、10、20、40μg/mL)分别作用于11种细胞系48h后，用MTT法检测TBL处理后不同细胞系的增殖情况．从Fig．2A中可见，TBL对正常细胞293T、HL7702及癌细胞HepG2、HeLa、MCF-7、QBC939、SGC7901的增殖均无明显影响．相同浓度下，TBL对正常结肠细胞FHC无抑制作用，仅对肠癌细胞DLD-1、HCT116及SW480细胞的增殖有显著的抑制作用(Fig．2B)，且呈剂量依赖效应，3种肠癌细胞的IC50值分别为17.8±0.36μg/mL，15.3±0.26μg/mL，20±0.30μg/mL．结果表明，TBL对结直肠癌细胞系的增殖有显著且特异的抑制作用．
2.3TBL对HCT116细胞形态的影响
TBL对HCT116细胞形态的影响采用倒置显微镜观察．结果表明，与对照组(Fig．3A)相比，10μg/mLTBL处理后(Fig．3B)，HCT116细胞数量明显减少，细胞边缘有变圆的趋势;20μg/mLTBL处理后，不仅细胞数量明显减少，而且细胞边缘整体发生变化，细胞轮廓模糊，细胞体积明显增大，细胞与细胞之间粘附增加，趋于成簇生长(Fig．3C)．
2.4TBL的N-糖苷酶活性和蛋白质合成的抑制作用
以兔网织红细胞裂解液系统和荧光素酶检测系统检测TBL对蛋白质合成的影响，实验结果表明，随着TBL浓度的增大，蛋白质翻译抑制作用逐渐增强，在TBL浓度为40μg/mL时达到完全抑制(Fig．4A)．而荧光素酶的活性随着TBL浓度的增大逐渐减弱，在40μg/mL时酶活性下降至50%(Fig．4B)．当将HCT116细胞总ＲNA与TBL体外作用后发现，ＲNA发生了明显的降解(Fig．4C)，说明TBL与ＲNA之间存在一定的相互作用．同时，当用不同浓度TBL处理兔网织红细胞裂解液后，随着TBL浓度的增大，兔网织红细胞的ＲNA逐渐出现新的切割片段(Fig．4D)．这些实验说明，TBL切割核糖体ＲNA的作用与蓖麻毒蛋白ricin［9］类似，具有N-糖苷酶的酶性功能，从而影响了蛋白质的生物合成．
2.5TBL对HCT116细胞中miＲNAs表达量的影响
为了检测TBL对HCT116细胞中miＲNAs的影响，用qＲT-PCＲ方法分析TBL处理后，HCT116细胞系中的miＲNAs的表达情况．选择了19种在结肠癌中表达较特殊的miＲNAs，从Fig．5可见，HCT116细胞经20μg/mLTBL处理24h后，有6种miＲNAs表达量下调(＞2倍)，分别是miＲ-21、miＲ-135a、miＲ-135b、miＲ-17-5p、miＲ-331和miＲ-183，其中5种均为肠癌细胞中的致癌miＲNAs;有2种miＲNAs表达量上调(＞2倍)，分别是miＲ-615和miＲ-206，二者在肠癌细胞中的表达谱中无明显规律;其余11种miＲNAs表达量变化不明显(0～2倍之间)．通过分析比较TBL对上述19种miＲNAs的影响，发现TBL对HCT116细胞中的miＲNAs表达量的影响主要表现为下调，在6种致癌miＲNAs中，对miＲ-21的下调最为明显．
3讨论
苦荞中含有许多种生物活性物质，目前已受到国内外相关专家的普遍关注，对其中的生物类黄酮，活性多肽及功能蛋白的研究已有较多报道［10］．然而，植物源苦荞凝集素的制备和抗肿瘤活性鲜有报道．本研究首次从苦荞(云荞1号)种子中提取出苦荞凝集素(TBL)，并发现其可特异的抑制肠癌细胞的增殖，而对正常细胞无毒性作用(Fig．2)．用兔网织红细胞裂解液系统和荧光素酶检测系统检测表明，TBL有N-糖苷酶活性和蛋白质的合成抑制作用(Fig．4)．Das等［8］用该方法证明Articulatin-D(一种从无叶槲寄生中提取的核糖体失活蛋白)具有N-糖苷酶活性．而早在1988年Endo等［9］已证明，蓖麻毒蛋白的N-糖苷酶活性能够将28SrＲNA茎环结构中的GAGA序列切去1个腺嘌呤残基，导致核糖体不能与延伸因子EF-2结合而抑制蛋白质的合成．由此我们认为，TBL具有N-糖苷酶的活性，且能抑制蛋白质的合成．同时，在倒置显微镜下观察到，TBL作用肠癌细胞后，细胞数量减少，且成簇生长(Fig．3)，推测是TBL的N-糖苷酶活性影响了细胞中有关增殖、粘附等蛋白的表达，从而影响细胞的生命活动．MicroＲNA是一种长度在21～23nt的非编码ＲNA，通过与靶基因mＲNA3'UTＲ区的靶位点区域相互结合而快速有效地降解mＲNA或抑制蛋白的翻译，将蛋白控制在生命活动所需的较低或最佳水平［11］．miＲNAs在不同肿瘤中有不同的表达谱，在肿瘤中表达上调的miＲNAs，通过抑制肿瘤抑制基因或细胞周期、分化或凋亡的基因，刺激细胞增殖，促进肿瘤发生，其功能类似于癌基因，因此被称为致癌miＲNAs(oncomiＲNAs);在肿瘤中表达下调的miＲNAs，可能负向调控癌基因或抑制细胞分化或凋亡的基因，其功能类似于抑癌基因，因此被称为抑癌miＲNAs(tumorsupressormiＲNAs)［12］．Li等［13］的研究显示，槲寄生凝集素(一种典型的Ⅱ型核糖体失活蛋白)通过降解miＲ-135a＆b的前体而下调其表达，从而抑制下游靶蛋白APC的表达，发挥抗癌作用．为了揭示外源物质TBL在抑制肠癌细胞增殖过程中对miＲNAs的作用，本文选择了19种在肠癌细胞系或肠癌组织中比较特殊的miＲNAs(Table2):其中6种为致癌miＲNAs(miＲ-21、miＲ-135a、miＲ-135b、miＲ-17-5p、miＲ-183、miＲ-200c)［14-16］，它们能够抑制多种抑癌基因的表达，如Pdcd4、PTEN、APC等，从而直接调控肠癌细胞的增殖、侵袭和转移［17-18］;5种抑癌miＲNAs(miＲ-143、miＲ-145、miＲ-34a、miＲ-760、miＲ-93)［19-20］，它们能调控信号通路中多种因子的表达，如ＲＲEB1、KＲAS、cateninδ-1等，调控癌细胞的多种生命活动［21-23］;8种其它癌症中的致癌、抑癌miＲNAs(miＲ-615、miＲ-331、miＲ-668-3p/5p、miＲ-661、miＲ-325、miＲ-206)［24-29］及在肠癌中存在争议的miＲNA(miＲ-419)［30-31］．研究结果显示(Fig．5):当用TBL处理HCT116细胞后，细胞中miＲNAs的表达有明显变化，其对6种致癌miＲNAs中的5种(miＲ-21、miＲ-135a、miＲ-135b、miＲ-17-5p和miＲ-183)表达表现出抑制作用．miＲNAs通常是裸露的，没有蛋白保护的ＲNA，相比核糖体ＲNA更容易被切割或修饰．我们推测，TBL可能发挥了N-糖苷酶的活性，切割HCT116细胞中高表达的致癌miＲNAs，从而影响肠癌细胞的生命活动，抑制肠癌细胞的增殖．Ｒushworth［32］提出，用天然化合物对miＲNAs进行调控可能是一种治疗癌症的新途径，miＲNAs能够作为新型治疗癌症的靶点．先前已有研究表明，天然提取物靶向miＲNA的抗癌作用，如槲寄生凝集素I能够下调miＲ-135a＆b的表达，从而增强miＲ-135a＆b靶蛋白APC的表达，发挥其抗癌作用［13］．我们推测，TBL特异的抑制肠癌细胞增殖的作用可能与其调控miＲNAs的表达有关．然而TBL调控miＲNAs的分医学期刊目录子机理及可能的分子事件还有待进一步研究．
作者：贾乔瑾 崔晓东 王转花 单位：山西大学生物技术研究所 化学生物学与分子工程教育部重点实验室
