1材料和方法
1.1材料
1.1.l兔红细胞CrR13C)成年大自兔心脏采血，肝索抗凝后加人PYS，离心1000r/min,10min弃上清，再加人PYS重悬红细胞后离心，重复3次以上，直至上层为清液。生℃保存。
1.1.2药物牛角地黄汤方剂中各药材均采购于北京同仁堂药店，加水煎煮2次，合并2次煎液，加热浓缩至质量浓度为100mg生药/mI。其他单方煎煮方法同上。各药液分装于玻璃瓶中，高压灭菌后，置生℃冰箱中保存备用。金黄色葡萄球菌。一溶血索，购于sirma公司。
1.2方法
1.2.1溶血毒素使用质量浓度的确定将200rRYC'与质量浓度为0-1fig/mI.HI.。等量混合，于37℃孵育0.5h后，3000r/min离心3min，取上清于96孔板中，于250nm处检测吸光度值，阴性对照加PYS，阳性对照(rRYC'完全裂解)加2TritonX-100。以使兔RYC'完全裂解的最小质量浓度的2倍作为后续试验的HLa使用质量浓度。
1.2.2药物处理分组药物处理分组试验用药物质量浓度为。v2.5mg生药/ml。第1组:将牛角地黄汤水煎剂或方剂中单一中药的水煎液与HLa共同处理:RYC'，于37℃分别孵育0.5-2h，然后进行溶血效应的测定。第2组:将牛角地黄汤水煎剂或方剂中单一中药的水煎液与HLa预先于37℃分别孵育0.5h和1h后再加人:RYC'孵育0.5h，进行检测。第3组:将牛角地黄汤水煎剂或方剂中单一中药的水煎液于37℃与rRIC'先分别孵育0.加人HI-a孵育。.5h，然后进行检测。5,2h后再2.3(%)-100%溶血活性的抑制率计算溶血活性抑制率
2结果
2.1中药煎剂与HLa同时给药处理rRBC不同时间后对HLa溶血活性的影响牛角地黄汤水煎剂在与HI。同时处理:RIC'后，随着药物质量浓度的升高，毒索的溶血活性被显著抑制，在2.5mg/mI时溶血毒索的活性抑制率达到了90%以上(图1)，药物与HI。处理:RIC'后作用不同时间的差异不显著。该结果显不牛角地黄汤剂具有抑制HI.a活性的作用。为了明确本方剂中发挥抑制溶血索活性作用的主要药物组成，将方剂中各单方药物水煎后用同样的方法进行试验。结果显不，在相同的药物质量浓度下赤芍水煎液的抑制溶血索活性的作用最强(图2)。在0.08m日mI时溶血抑制率仍达”%以上，丹皮次之，在0.63m日mI溶血抑制率达”%以上，而钩藤、牛角和生地水煎液在当前质量浓度下末检测出明显的抑制溶血索活性的作用。
2.2中药煎剂与HLa预先作用不同时间后处理rRBC对HLa溶血活性的影响将牛角地黄汤与HLcx预先作用0.5-2I:后检测HLa溶血活性。结果(图3)显不，随着牛角地黄汤与HLcx预先作用时间的延长溶血抑制作用增加，0.63m日mI的牛角地黄汤煎剂对HLcx溶血活性的抑制率达到80%以上，并呈现时间依赖的关系，且显著高于:RYC'同时处理的作用效果。各单方水煎液的作用效果研究结果(图2)显T，赤芍与HLcx预先作用1I:后其对HLcx溶血活性的有同样的抑制作用，而丹皮与HLcx预先作用1I:后其对HLcx溶血活性的抑制作用有明显增加，在0.08m日mI下溶血活性抑制率达到90%以上，钩藤水煎剂在该处理条件下也表现出对HLcx的活性的抑制作用，在2.5m日mI时的抑制率达到”%以上，较与RYC'和HLcx同时作用时抗溶血作用显著提高。而牛角和地黄在该试验条件下末表现出显著的抗溶血活性作用。将HI-a分别与钩藤和丹皮水煎液预先处理。.5h和2h后检测了溶血活性，结果显不(图5)钩藤和丹皮在预先处理HI.a后其抗溶血作用明显提高，丹皮在0.08mg/mI溶血活性抑制率达90%以上，钩藤在2.5mg/mI抑制率可达90%以上，明显高于药物与HI.a同时给药处理:KIC'的作用效果。0.5h和2h的处理时间间的差异不明显。以上研究结果提不赤芍、丹皮和钩藤水煎剂对HLcx的活性抑制作用口1一能是通过直接干扰HLcx的作用而实现抑溶血活性的作用。
2.3中药煎剂与rRBC预先作用不同时间后染毒HLa对溶血活性的影响将牛角地黄汤以及各单方水煎液预先与:RIC作用30min和1I:后再加人HLcx，其溶血效果显T(图6A)，随着牛角地黄汤药物质量浓度的增加，其溶血抑制率明显增加，并且随着与:RIC作用时间的延长其抑制溶血活性的水平显著的升高，与药物和HLcx同时处理rR13C相比，在低质量浓度的条件下，其溶血抑制率也口1一达到60%以上。在单方的水煎液的作用中钩藤的作用最为显著(图613)，其他各单方水煎液在与RIC预孵育后末表现出明显的保护红细胞方面的作用。本试验结果显不牛角地黄汤以及方剂中钩藤均有明显保护红细胞的作用。
3讨论
长期以来，人们对细菌感染性疾病的治疗都是使用具有高效抗菌活性的抗菌药物，这些药物的靶标多是细菌中非常保守的蛋自质分子，涉及到细菌细胞壁的合成、蛋自质的合成、IANA的复制等生命活动的基本过程。虽然这些抗菌药物对敏感菌株所致疾病的治疗效果很好，但是，细菌耐药性的出现严重影响抗生索的使用寿命。其中耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的出现，已成为全球关注的问题‘川。实践证明，中(兽)医药在防控动物细菌感染性疾病中有显著疗效，而且在疾病治疗方面表现出异于西药的特点和优势，如:与抗生索相比有较小的毒副作用、很少发生耐药性等。中药的抗细菌感染的作用扫L制尚不清楚。已有的药理研究显不，赤芍的药理作用广泛，具有抗炎、抗过敏、调节免疫等作用2〕，在体外还有部分抗微生物、稳定红细胞膜结构，减轻炎症造成的损伤的作用「:3-。丹皮和赤芍同为芍药科的植物，具有相似的主要成分，如所含的氧化芍药戒、芍药内酷戒、苯甲酞芍药戒对红细胞膜有较强的稳定作用。药理研究显不，犀角(牛角)具有显著解热镇静促凝血活性的作用6es，可改善IMC模型大鼠的凝血功能了es。钩藤提取物能保护红细胞膜对抗自由基诱发剂2,2c一偶氮二(2-眯基丙烷)二盐酸盐(AAPH)引起的溶血，表现出它对红细胞的保护作用吕es。以上各中药组成的牛角地黄汤剂在与细菌溶血毒索的相互作用时是否也能表现出相应的保护作用，还末见报道。本研究通过中药与细菌毒力因子的相互作用的研究发现以牛角地黄汤为基础方的钩藤牛角地黄汤具有抑制溶血毒索的溶血活性作用，在方剂组成中生药赤芍约占组成成分的15%左右，而赤芍在0.15mg/mI就具有明显抑制溶血活性与牛角地黄汤剂在2.5mg/mI表现出的抑制溶血活性的作用相当，这提不赤芍是牛角地黄汤中抑制溶血活性的主要成分，因丹皮与赤芍具有相似的有效成分，在牛角地黄汤中与赤芍协同作用抗细菌溶血毒索的活性。本研究发现牛角和地黄并不具有直接抑制细菌溶血毒索活性的作用，在牛角地黄汤方解中牛角和地黄为君药，其主要作用可能与提高机体对抗外来微生物的响应有关，其作用机制还不完全清楚。在本研究中钩藤直接抗溶血毒索活性的作用不如赤芍和丹皮的作用强，但是对红细胞具有一定的保护作用。中药复方制剂成分复杂，各味药口1一能有其独立或共同的作用靶点，而且单味中药经配伍后，在加工过程中，药物之间相互作用还口1一能形成新的产物，虽然本文研究发现牛角地黄汤具有抑制细菌主要的毒力因子—细菌溶血索活性的作用，但是，在临床上是否口1一以通过上述陕西职称试验模式治疗细菌感染性出血性斑疹，还有待进一步研究。
作者：李增顺 宋繁 张银花 孙英健 单位：北京农学院动物科学技术学院
