1乳腺癌肿瘤微环境
近年研究表明肿瘤微环境对癌细胞的转移和侵袭性起决定作用，纵容性的肿瘤微环境可使早期癌变细胞转移[1]。乳腺癌肿瘤微环境是由癌细胞和多种基质细胞、细胞因子、趋化因子等组成。
1.1恶性基质化及其分子表达
研究发现，恶性肿瘤局部微环境中均存在大量免疫细胞，它们在肿瘤组织中的分布、密度和功能状态等组成的综合免疫网络可以成为较准确的独立预后预测因素[2-3]。而癌变与恶性基质化是平行进行的，在癌变的起始阶段，肿瘤细胞诱导正常基质细胞为起始改变的细胞，并占据了基质与肿瘤间的反馈回路、激活基质的表型，最终成为互不依赖的不可逆的肿瘤和转化的基质表型。原发灶和转移灶中基质细胞的主动迁移促进了肿瘤细胞的侵袭和转移能力。在此过程中，基质中的细胞成分从保护机体的免疫机制转变为支持肿瘤细胞生长、增殖、浸润、转移的“辅助肿瘤的细胞”，其中主要的细胞为肿瘤相关的成纤维细胞（Tumor-associatedfibrob-last，TAF）、肿瘤相关的巨噬细胞（Tumor-associatedmacrophage，TAM）、肿瘤相关的树突状细胞（Tumor-associateddendriticcell，TADC）等。1.1.1关于TAFTAF是原位肿瘤和转移癌组织的特征性间质表现，其作为血管旁细胞成为组织结构调节者和免疫调节细胞参与肿瘤的发展过程，把癌细胞和淋巴细胞分隔开，降低了免疫系统对肿瘤细胞的监视和杀伤作用[4]。在肿瘤组织中TAF分布于肿瘤侵袭前沿、肿瘤-间质界面或肿瘤间质中靠近肿瘤血管内皮细胞并包绕着癌巢。CD34+的成纤维细胞的丢失是浸润性癌间质的特异变化，是判断局部有无微浸润的敏感指标；而浸润性癌灶中出现杂乱排列的表达α-SMA的肌纤维母细胞，可能由CD34+细胞转变而来。TAF的重要意义在于它为乳腺癌的病理诊断、预后判定和生物治疗提供了一个有前景的靶目标。1.1.2关于TAM在肿瘤的发展过程中，TAM被认为起着双刃剑的作用。M1表型的TAM可以分泌免疫调节因子和酶来发挥抗肿瘤免疫作用，并将肿瘤抗原呈递给细胞毒T淋巴细胞；M2表型的TAM可以被肿瘤微环境所诱导，分泌促有丝分裂因子来促进肿瘤生长并抑制对肿瘤的免疫反应，同时还通过释放血管生成因子和ECM调节因子直接或间接地促进血管生成和肿瘤转移[5-6]。研究结果表明肿瘤早期巨噬细胞以M1表型（高表达IL-12/23而低表达IL-10）为主，而晚期以M2表型（低表达IL-12/23而高表达IL-10）为主[7-9]。巨噬细胞有抑制肿瘤增殖的作用还是促进血管新生、加速肿瘤转移的作用，主要取决于巨噬细胞的表型及肿瘤细胞的内在特点。1.1.3关于TADC在肿瘤发生过程中，理想状况下，DC被募集到肿瘤区，在此捕获肿瘤抗原，迁移到区域淋巴结，成为表型成熟DC，在局部激活抗瘤免疫反应。然而肿瘤组织分泌的大量免疫抑制性的因子以及由于实体瘤生长迅速，原有组织血管很快不能满足其氧需求而在局部形成的乏氧微环境可能对DC的迁移能力产生损害，使其处于未成熟状态，不成熟DC不能有效提呈抗原，形成免疫逃逸机制，成为肿瘤发展和转移的基础[10]。有小样本研究表明，乳腺癌中不成熟树突状细胞在瘤体内散在分布，而成熟的树突状细胞存在于癌周区域。不管是新鲜分离还是培养的淋巴细胞、NK细胞或单核细胞都没有发现CD83的表达。体内生理性存在的DC也不表达CD83，而只有体内激活的DC才表达CD83。因此CD83被认为是DC充分成熟的标志。乳腺癌形成过程中肿瘤细胞可以改变周围基质成为有利于其生长并支持肿瘤进展的细胞外环境，肿瘤的发展阶段依赖于基质的激活程度，成纤维细胞被激活为肌成纤维细胞，巨噬细胞数量增加包绕癌巢，树突状细胞引起的免疫逃逸机制等是肿瘤发展和转移的基础，而这些肿瘤相关基质细胞不同活化状态、不同表型及不同成熟状态决定了乳腺癌的恶性基质化程度，也决定了乳腺癌的生物学行为。
1.2肿瘤血管异质性及其分子表达
目前的研究认为肿瘤血管生成开关的启动可发生在肿瘤演进的任何阶段，由肿瘤的类型和微环境决定，微环境中肿瘤相关基质细胞的主动调节起到了关键作用，这种调节在空间、时间表达水平的不协调性导致肿瘤血管生成与生理状态下的血管生成存在显著差异，这类差异性也称为“肿瘤血管异质性”[11]，包括新生血管结构的成熟度、血供特性、内皮细胞增殖活性和基底膜特点及分子遗传学改变、血管淋巴管形成参与情况、血管生成相关性病变及结局等。1.2.1肿瘤血管空间分布有学者[12]将肿瘤血管分成3个区域：①肿瘤中心带，血管稀少，很少有分支或吻合支，存在大片无血管区，认为中心带与肿瘤坏死有关。②肿瘤外带，血管密集，窦状扩张，相互吻合成袢，提示外带是肿瘤细胞生长旺盛区。③肿瘤周围组织带，血管粗大迂曲，互相融合成片状、胚窦样。血管最丰富区域多位于侵袭性生长的肿瘤边缘，边缘区域的血管化程度有高于中心区域的趋势。在恶性肿瘤中心区域由于肿瘤血管自身结构的缺陷，肿瘤中心部间质内压增高，肿瘤中心部血管内压下降3个方面的因素造成肿瘤中心区域血管化和血流灌注降低，这也是恶性肿瘤中心部更容易出现坏死的原因。1.2.2肿瘤血管生成经典的乳腺癌肿瘤血管生成模式是实体瘤周边的瘤细胞伸缩，将紧邻的宿主毛细血管静脉端的基底膜降解，导致血管内皮细胞的迅速增殖并向肿瘤迁徙，形成有功能的管状结构（毛细血管袢），继而与宿主血管发生吻合，由此构成肿瘤的血液循环系统[13]。除此之外肿瘤血管生成拟态（Vascu-logenicmimicr，VM）也参与其中，且与肿瘤的生长、分化程度、侵袭性等密切相关。VM是近几年来提出的，对经典的内皮依赖性肿瘤血管生成理论提出挑战。1999年发现人眼葡萄膜黑色素瘤细胞演化成的血管样通道结构，CD31、CD34等均呈阴性反应，PAS染色阳性物质，管腔内没有血管内皮细胞衬覆，肿瘤细胞模仿血管内皮细胞血管生成并通过自身基因型反转变形和细胞外基质重塑形成瘤细胞条索样微循环管道，为肿瘤细胞提供血液供应[14]。在随后的研究中发现在肝癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌中同样存在VM。实际上，肿瘤血管异质性不仅表现为肿瘤血管与非肿瘤新生血管的差异性，还应包括不同肿瘤之间、同种肿瘤不同个体之间、同一肿瘤不同区域的发生与演进阶段之间的血管差异性[15]。
2乳腺癌肿瘤微环境的超声研究进展
2.1恶性基质化特征
2.1.1二维超声的边缘显示如二维超声表现为边缘不光整，有毛刺，病理学镜下可见癌成排或成列浸润至周边的正常腺体和脂肪组织，肿瘤细胞与正常组织相间分布，癌周边常可见增殖的纤维结缔组织、血管、淋巴管呈簇状生长或条索状分布[16]。超声表现为强回声晕，其病理基础是癌细胞向周围组织浸润，出现癌细胞、脂肪细胞和纤维组织的混杂[17]，或是癌周围结缔组织的反应性增生，呈现了不规则的界面所引起的[18]。2.1.2三维超声乳腺三维超声成像技术主要是利用计算机对采集到的一系列二维图像信息进行加工处理即重建，从而构成三维图像。通过多平面成像的旋转和平行移动可以显示乳腺肿块的形态、内部结构及其与周围组织的关系；可较清晰地显示肿瘤对周边组织的浸润情况；计算肿瘤的体积；三维超声成像在评估肿瘤形态、生长方式以及指导手术等方面可以提供更多的信息[19]；对肿瘤的穿刺三维超声的引导可以准确定位，并可以直观立体地显示针尖与病灶的位置关系。2.1.3超声造影恶性肿块表现为边缘的不均一性或者周围有一段高增强的环状表现，并且可以看见灌注缺损和周边径向的穿透血管。对灌注缺损的一个可能解释是恶性肿块生长较快，血管形成和营养供给相对不足，以至于肿块局部缺氧和坏死。肿块周围呈放射状或者穿透性血管的检出率能显著提高。乳腺超声造影最具临床应用价值的是对浸润性乳腺癌新辅助化疗的评价。乳腺癌患者新辅助化疗反应的传统评价主要取决于肿块尺寸的改变。在新辅助化疗后，超声造影测量的肿块大小常常比传统超声测量的要大；超声造影在乳腺切除术后的组织标本显示的肿块大小也更为精确。2.1.4弹性成像生物组织的硬度与病灶的生物学特性紧密相关，在很大程度上取决于组织的分子构成及这些分子所构成组织的形式，此外其与周围相邻组织情况也相关[28]。通常恶性肿瘤多呈蟹足样浸润生长，与周围组织紧密结合，常规二维灰阶超声常无法准确显示乳腺癌的浸润部分，然而乳腺癌的浸润部分的组织硬度却与周围正常组织有明显的差异，根据硬度的不同可以明确其边界。由于癌周的恶性基质化，癌瘤直接向外浸润扩展，癌细胞沿乳腺导管扩展，或是癌周小梁结构向肿瘤方向牵拽致肿瘤边缘带组织具有很高的硬度，故恶性病灶在弹力图上显示的范围往往要远大于二维图像所显示的范围。说明乳腺癌边缘带的恶性基质化与肿瘤的硬度有关联，而反应肿瘤硬度的弹性评分与恶性基质化的相关性如何有待于进一步研究。
2.2肿瘤血管异质性
2.2.1二维能量多普勒成像乳腺癌彩色多普勒血流显像的相关因素主要有肿块大小、分化程度及患者年龄[20]，肿块越大、分化程度越低，血流越丰富，但随着患者年龄增长，血流减少。与彩色多普勒血流显像相比，二维能量多普勒成像（PDI）对肿瘤内的血管及血流信息，特别是对低速血流的显示更为敏感，但不能全面、整体地反映肿瘤内部血管网络的分布情况。2.2.2三维彩色多普勒超声新近出现的三维多普勒超声较二维彩色多普勒超声更为敏感地显示血管，能够立体显示肿块周边及内部的血管走行及分布情况，并可定量评价肿瘤血供的丰富程度。检查者只需将其固定于体表并指向所需扫查的部位，系统就会自动采集二维图像，不需要进行图像后处理即可以获得三维立体容积数据库并能立刻显像。通过计算肿瘤体积及其内彩色像素的多少，计算机软件可以自动获取VI值、FI值及VFI值。2.2.3超声造影定性及定量评价乳腺癌的新生血管代表了肿瘤的生物学活动，而且也是新辅助化疗的有效性的准确评估。超声造影可以显示肿块的微小血管的分布以及弥补传统超声和彩色多普勒超声不能很好识别微小血管的不足[21]。超声对比增强造影对肿瘤血供的评价主要包括定性和定量评价。定性评价主要包括造影剂的增强速度、强度、分布及肿瘤血管走行情况等，其优点是能快速、直观地判断和评价肿瘤的血流分布情况[22]，缺点是主观性较强[23]。定量评价通过应用分析软件绘制时间-强度曲线，能最大程度地避开分析者主观因素的影响，是定性评价的必要补充[24]。研究显示，恶性肿瘤组病灶边缘的峰值强度、曲线下面积、廓清时间大于病灶中心区域，病灶边缘的达峰时间小于中心区域[22]。相比传统超声，超声造影在对于新辅助化疗的评价有一些明显的优势：在新辅助化疗的前后，可以定量评价肿块血流灌注的程度。但二维灰阶造影也存在一些缺点：直观性较差，不利于观察小血管的病变；对不在同一平面的多条血管结构不易准确诊断，单幅断面图像不能准确、全面反映三维空间内的血管分布，对Z轴上走行的血管不易显示。新近出现的三维超声造影技术，将灰阶超声造影和三维超声成像相结合，有效地解决这些问题[21]。应用三维超声造影技术可观察到恶性肿瘤血管的血管环，静脉末端的静脉湖、盲端静脉及动静脉瘘，显示新生血管的迂曲走行和不规则形态，并显示肿瘤整个微循环结构，而肿瘤血管的数量、结构和分布是时间强度曲线形态不同的病理基础。2.2.4超声分子影像学2004年郑元义等[25]首次在国内提出“超声分子影像学”的概念，该技术是将特异性配体与直径小于红细胞的超声造影剂连接，通过血液循环使其特异性地在靶组织聚集，观察在分子或细胞水平上靶组织的特异性显像，反映在分子水平上病变靶组织的改变。Bzyl等[26]用VEGF2与微泡造影剂表面连接导向乳腺癌肿瘤血管内皮表面与其配体结合，可以真实地反映VEGF2在乳腺癌肿瘤内的聚集情况，甚至能以此描述肿瘤内新生血管的细微差异。但超声分子探针的靶向性能需与化学、免疫学等多学科交叉研究才能制备出可以应用于临床的靶向分子探针。2.2.5超声光散射成像近年来，由新奥博为技术有限公司自主研发的OPTIMUS超声光散射乳腺成像系统，将超声成像技术和光学技术融为一体，可以间接反映肿瘤内部血管生成活性及氧含量情况等信息，并得出综合诊断指数（SDI），能够区分组织中的散射与吸收效应，通过非侵入性的方式更加准确地定量测量并监测局部血液参数，并能同时对局部血液参数进行断层成像，有助于肿瘤的早期诊断。光散射成像在新生毛细血管变化意义上具有较高的功能分辨力，可为乳腺癌的早期诊断提供依据[27]，但某些良性病灶因血管较丰富会导致OPTIMUS评分过高，或者肿块位置过于表浅、探头与皮肤接触不够严密而漏光。
3乳腺癌肿瘤微环境超声研究的关键及展望
乳腺癌细胞在瘤体边缘沿结缔组织间隙和脂肪间隙向外浸润蔓延，引起结缔组织反应，反应方式一般有两种，一种是以成纤维细胞、组织细胞、淋巴细胞、浆细胞和巨噬细胞为代表的活性结缔组织在瘤体周围形成的瘤周间质反应带。肿瘤中活跃的间质细胞分泌细胞因子和生长素。如通过对肿瘤细胞的旁分泌刺激以促进其生长[28]。肿瘤基质部分控制肿瘤的生长、侵袭和血管形成，对免疫反应也起到一定影响[29]。另一种是起支架作用的结缔组织增生。在浸润性病灶周围常见增生的纤维组织先于癌细胞向外伸延，形成瘤周毛刺。无论是哪种恶性基质化的反应方式，都印证了肿瘤的边缘带是乳腺癌生物学行为的关键部位。随着超声技术的发展，超声诊断已进入多模态诊断方式，在常规超声的基础上应用超声造影、三维技术、弹性成像及超声光散射成像往往能改变常规超声的BI-RADS分级，丰富诊断信息。还可以综合应用各种诊断技术中最有价值的征象评估乳腺癌的肿瘤微环境情况。在肿瘤恶性基质化方面展示良好的有二维超声的边缘显示、弹性评分、三维超声边缘显示、超声造影对肿块大小形态显示；在肿瘤血管异质性方面展示良好的有二维能量多普勒成像、三维彩色多普勒超声、超声造影定性及定量评价、超声分子影像学、超声光散射成像。超声医生综合应用多种模式可丰富乳腺肿瘤恶性基质化及肿瘤血管异质性的信息，为预测预后及为抗恶性基质化、肿瘤血管生成、肿瘤血管拟态的基因疗法、手术切除等治疗方案的选择提供重要的依据，并可为进一步的深入研究打下前期研究基础，如研究靶向声学造影剂，同时携带治疗性药物、基因，经超声辐照后定向释放，进行抗恶性基质化、肿瘤血管拟态分子靶向治疗，使基于肿瘤微环境水平的乳腺癌的个体化治疗成为可能，并使其有潜力应用于并在活体中进行疗效监测。
作者：冷晓玲 马富成 单位：新疆医科大学附属肿瘤医院
