近几年姜黄素在预防医学眼科中的应用研究开始受到关注,但一定剂量范围内姜黄素是否有抗衰老作用,尤其对人视网膜色素上皮细胞的衰老能否起延缓作用,目前文献报道较少,本研究通过不同剂量姜黄素干预RPE的衰老,现将结果报告如下:
1.资料与方法
1.1一般资料:选取来自非肿瘤及炎症性眼球摘除的患者的原代培养的人视网膜色素上皮细胞,随机分为观察组和对照组两组。观察组与对照组年龄均在20~30岁之间,两组基本情况差异无统计学意义。(P>0.05)
1.2方法:
1.2.1人RPE原代培养及鉴定:
常规消毒摘除的眼球并浸泡在含有10000U/ml的庆大霉素的D—Hank’S液中，置于4℃,存放15min，沿锯齿缘后2~3mm处，环形剪开眼球的前端，去除角膜及晶状体玻璃体，将眼球后部放射状剪开，将其平铺在培养皿中，解剖显微镜下用无菌的枪头轻轻的从眼杯中吸出视网膜神经上皮层，用D-HankS液漂洗眼杯2次，吸干；加入0.125%胰蛋白酶，0.01%EDTA,于37恒温箱中消化30min，吸取消化液，以D—Hanks液漂洗；加进含有血清的培养液，终止消化酶作用，用吸管吸取培养液，轻轻的吹打眼杯内壁，以使RPE细胞脱落；收集眼杯内的细胞悬液，1，000rpm离心，10min后弃上清液，将沉淀的RPE细胞，重新用培养液悬浮；细胞计数以8-10×104/mL的密度接种在培养瓶内。以含10%的胎牛血清的DMEM培养基，在37℃、5%CO及饱和湿度的环境中培养。每2~3天传代一次。倒置相差显微镜下观察:细胞呈不规则多角形,中央有一圆形透明区为细胞核胞浆内含较多色素颗粒。培养的RPE细胞接种于24孔板中于接近融合时,用4%多聚甲醛固定10min,PBS洗3次X3min。加入3%的H2O/甲醇，在室温下PBS洗3次，每次3min。加入含10%的小牛血清PBS，37C°下孵育1h。再加入1：500稀释的羊抗鼠IgG,37℃孵育1h后，用PBS洗3次，每次3min，结束后用DAB显色，镜检，胞浆呈棕色为阳性。
1.2.3MTT法(噻唑兰比色分析法)检测细胞增殖率:
细胞常规消化,同时接种于96孔板,4000个(200μl)/孔,分别于接种后24、48、72小时行MTT检测,将浓度为5mg/ml的MTT(Sigma)以每孔20μ加入待测的96孔板内,37℃培养4小时,弃上清液,每孔加DMSO200μl并振荡15分钟,最后用紫外分光光度计570nm波长测定各孔的吸光度(A值),取每组8孔的均值。只加培养液的孔作为空白对照,求出第5、10、20代细胞的相对增殖率。
1.2.4β-半乳糖苷酶染色:
6孔板中培养的细胞,吸除细胞培养液,用PBS洗涤1次,加入4%多聚甲醛室温固定15分钟;吸除细胞固定液,用PBS洗涤细胞3次,每次3分钟。吸除PBS,每孔加入溶于铁离子液的1mg/mlX-gal溶液,37℃孵育过夜,用保鲜膜封住6孔板防止蒸发;用PBS洗涤细胞3次,每次3分钟,伊红复染3-5分钟,自来水冲洗伊红染液,烤干,中性树胶封片,普通光学显微镜下观察。
1.2.5不同剂量姜黄素干预RPE后上述指标的变化:
用DMSO配制的姜黄素2.5、5、10、20umol/L(培养液中DMSO<0.5%)加入第5代细胞,分别收集第5代姜黄素处理后24h、第10、20代细胞进行相关检测。对照组不加姜黄素仅以新鲜无血清培养基培养。各实验组设>3次对照。比较不同剂量干预间及与对照组间差别。
倒置相差显微镜观察不同代次形态学改变(方法同1.2.2);MTT法(噻唑兰比色分析法)检测细胞增殖率(方法同1.2.3);β-半乳糖苷酶染色(方法同1.2.4)。
1.3统计学方法:全部数据均采用SPSS16.0软件统计分析,计数资料用x2检验,计量资料2组间比较用t检验。当P>0.05时表明在统计学上无差异;当P<0.05时表明有统计学上的差异。
2结果:
2.1观察不同代次形态学改变:
观察从眼杯内分离出来的RPE原代细胞为圆形，漂浮在培养液中，胞浆内含较多黑色素颗粒，倒置相差显微镜下看不到细胞核。当细胞贴壁后，伸出伪足，变成不规则的多角形，中央可见一圆形透明区为细胞核，5~7d后，细胞基本融合成单层，随着传代次数的增加，胞浆内的黑色素颗粒逐渐减少，在同一培养瓶内，不同细胞可因细胞分裂次数的不同，出现黑色素颗粒含量不同的情况。随后细胞生长缓慢,传代后细胞贴壁数量减少,直至死亡,第5、10、20代培养的人视网膜色素上皮细胞,随着传代次数增加,细胞形态学出现明显改变,衰老的细胞比例明显增加,细胞增殖能力明显下降,以第20代细胞更为明显。
2.2不同剂量姜黄素(2.5、5、10)干预人视网膜色素上皮细胞结果:与对照组比较,观察组衰老相关的指标β-半乳糖苷酶染色及细胞特异性的形态学及增殖能力、存活时间等指标均有改善，小剂量组各时间段抑制作用随着时间的延长而增高，差异有统计学意义(P<0.05),MTT法检测不同药物浓度的姜黄素对RPE增殖的抑制作用。
3讨论:
姜黄素是从姜科植物的根茎姜黄中提取的一种酚性天然色素,是姜黄的主要成分,是一种抗氧化剂。早期对姜黄素的大量研究已证实一定浓度范围内具有抗肿瘤、诱导细胞凋亡等作用,姜黄素可序列诱导caspase-8活化,裂解BH3结构域凋亡诱导蛋白抗体,导致线粒体膜电位丧失，转运孔开放，释放细胞色素C,活化caspase-9和caspase-3，裂解多聚腺苷核糖聚合酶和caspase活化的脱氧核糖核酸酶抑制剂，最终导致DNA断裂，凋亡形成。姜黄素诱导细胞凋亡的另一个机制可能与下调凋亡蛋白(bcl-2,bcl-xl,c-myc,野生型p53)水平，上调凋亡蛋白(Fas)水平有关[1-3]。近年来,姜黄素在眼科领域有较大的应用,边芳等[3]研究发现,姜黄素可显著抑制体外培养的人翼状胬肉成纤维细胞增生，将细胞周期停滞在G0/G1期，并诱导其凋亡，作用呈时间和剂量依赖。安建斌[5]等在姜黄素抑制兔视网膜色素上皮细胞增生的机制研究中发现,姜黄素能有效抑制RPE细胞增殖,其机制可能为影响PCNA的合成,诱导RPE细胞凋亡,姜黄素有望成为一种高效的防治PVR的理想天然药物。本研究发现比较第5、10、20代培养的人视网膜色素上皮细胞,随着传代次数增加,细胞形态学出现明显改变,衰老的细胞比例明显增加,细胞增殖能力明显下降,以第20代细胞更为明显,应用小剂量姜黄素(2.5、5、10、20umol/L)干预人视网膜色素上皮细胞,与对照组比较,衰老相关的指标β-半乳糖苷酶染色及细胞特异性的形态学及增殖能力、存活时间等指标均有改善。综合上述研究认为,在眼科预防医学中，不同剂量范围的姜黄素可能通过不同的机制发挥不同甚至相反的药理作用。因此,姜黄素能直接延缓人视网膜色素上皮细胞衰老,同时本研究为姜黄素在眼科预防医学领域的应用提供更深入、有意义的探索。
