1检验品种真实性和纯度的方法
检验品种真实性和纯度的方法有很多,根据不同的原理可分为形态鉴定、生理化学法鉴定、物理法鉴定、细胞学方法鉴定和分子生物学鉴定。运用分子生物学方法来鉴定品种纯度的方法有很多,它是在DNA和RNA等分子水平上鉴别不同的品种,目前最常用的技术主要有以下几种:SSR技术又称为microsatelliteDNA、RAPD技术、AFLP技术、RFLP技术和SNP技术。应用最广泛的就属SSR技术,最有应用前景的要数SNP技术[2]。
1.1运用SSR标记技术鉴定品种的纯度和真实性
近年来越来越多的种子企业都应用SSR技术来鉴定品种的纯度,DNA分子标记技术是通过诊断生物的内在基因排布规律和外在的表现规律,并直接分析遗传物质的多态性,同时通过比较不同品种的DNA的结构和组成,以此来鉴别品种的纯度和真实性的。该技术可以反映生物个体和种群之间有差异的片段,正因为此技术的不受时间、空间和外界环境的因素影响,所以其检测结果更真实可靠,也便于自动化管理。由于SSR技术呈共显性遗传,然而相比于其他的遗传方式,它可以清晰地分辨出种子的纯合体和杂合体,所以就成为了目前最广泛应用并最受欢迎的检测技术。SSR技术是由一个到六个核苷酸串联成100bp以内的DNA片段,在基因的复制过程中,及碱基的错配会产生几个重复单位,就使得基因组每次都会突变成几个重复的单位,导致等位基因的出现,当运用电泳技术进行分离后,就轻而易举的获取了这些重复序列的信息[3]。
1.2PAPD技术
PAPD技术是以基因组为模板,并对农作物进行PCR扩增,最终得到多态性的DNA谱带的一项技术,此项技术有很多特点,如操作简单、经济快捷、基因需求量小等,并且在向日葵、扁豆、芹菜、棉花、甘薯等植物的检测均有报道,虽然对于已经筛选出来的种子进行指纹分析是比较方便和快捷的,但是对于未检测过的新品种,想要在短时间内找到合适的引物进行鉴定难度很大[4]。
1.3RFLP技术
这项技术的原理是通过检测不同的遗传位点的变异,它能够区分不同生物个体间基因的微小差异,由于同一个农作物能够在不同品种中找到许多的标记,所以这项技术是在检测品种的真实度和纯度的方法中最可靠的方法,但是其操作过程繁琐、操作难度大、周期长、费用高[5]。
1.4AFLP技术
AFLP技术的原理是在检测过程中选择基因组DNA的酶切片段,其标记技术优点有重复性强、稳定性好、多态性高等,实验证明在克隆技术上此项技术拥有很好的前景,但是由于实验对DNA纯度和内切酶有高质量的要求,基因组的不完全会影响实验的结果,而且此方法不仅操作程序长、步骤多,还要求有很高的实验技能和精密的仪器,因而在对农作物的真实性和纯度的鉴定中难以普及和应用[6]。
2如何验证分子生物学技术的可靠性
2.1验证方法
为了验证分子生物学技术的鉴定结果是否可靠,需要进一步的确认,通常实验都会采用两种纯度检测的方法来验证,一般会选择分子标记鉴定和田间纯度鉴定法,根据有无亲本的两种情况,对已经知道亲本的生物运用共显性鉴定法,即基因在亲本之间表现为多态性,在杂交一代中表现为共显性的生物。对未知亲本的作物采用多态性扩增的方法[7]。田间种植鉴定,分别在田间正季和异地种植,以水稻为例,田间正季鉴定材料种植在四川两种实验基地,单粒播种,每个样品种植200株,常规管理,海南异地种植在三亚种植基地,通过分析种植的产物的特征特性来最终得到田间鉴定结果。鉴定依据要严格按照种子检验规程执行,对产物性状的审定同样按照规则审定描述进行。
2.2结果分析
通过实验得到信息后对结果进行分析,谱带种若出现双亲互补的为杂交种,若母本出现纯和带类型为不育系,谱带如图3-1所示,以此来计算纯度的百分比,将得到的鉴定结果和田间实验的鉴定结果比较,验证了24对引物的结果准确。另外发现在经过生物技术检测的纯度和田间正季的鉴定结果相关系数可达到93.8%,在田间鉴定过程中不同的鉴定者鉴定的结果也有很大差异,过程中很难区分杂株,将分子技术检测结果与田间检测的性状做对比,在田间表现为不育系的大多分为两种情况,第一是在田间表现为不育株的在SSR检测中变下为母本不育,第二是田间表现为异型株的检测为母本不育系,其谱带表现如图3-2所示,分子标记检测结果与田间种植检测结果比较如图3-1,分子标记检测纯度与田间种植检测纯度比较结果如图3-2。经过以上研究分析得出,在品种纯度测定中,所用的引物越多、样本容量越大检测得出的结论(见表3-1、表3-2)越可靠,在实际的检测中,为了兼顾经济性和准确性,一般选用3对引物来进行检测,在品种真实性和纯度的鉴定中,大多数人们认为分子标记鉴定结果比田间鉴定的结果更为严格,所以对企业就相对有失公平,本研究显示其电泳结果更接近于田间种植结果,这一研究结果为接下来的分子鉴定提供了更有力的依据。但是就针对于农作物真实度和纯度的鉴定而言,分子标记的结果和鉴定结果相一致,且检测时间短,能迅速为种子的监管工作提供有力依据和技术支撑,更大力度的减少由种子不合格带来的经济损失和不良社会影响[8]。
3讨论
对于利用分子生物学技术对农作物品种的真实性和纯度进行检测的方法各有优缺点,但是无论是常规鉴定技术还是化学物理鉴定技术都各有局限性,不能满足种子纯度和育种工作的发展需求,可以相信,随着分子生物学技术的不断发展,更多更有效的分子标记技术将会在学者的不断努力下得到革新和不断完善,在不久的将来,分子生物学技术将会直接应用到农业的发展中去,通过本文以上的研究,可以得知分子生物学技术的最终检测结果和田间实际种植的结果大致相同,所有有理由相信经过不断地发展和研究,最终分子生物学技术对农作物真实性和纯度的检测结果将于实际差距越来越小,发展分子生物学技术将是鉴定农作物真实性和纯度未来的发展方向。
作者：王立 单位：江门市新会区林业科学研究所
