一、试剂与仪器
DMEM细胞培养液（Hyclone公司）；胎牛血清（杭州四季青胎牛血清）；0.25%胰蛋白酶（美国Gibco公司）；无菌PBS溶液（上海交通大学附属第六人民医院中心实验室提供）；Lipofectamine2000（Invitrogen公司）；pEGFP质粒（上海交通大学附属第六人民医院中心实验室杨翠霞博士赠予）；超声造影剂SonoVue（意大利Bracco公司）为六氟化硫微泡。超声频率为20kHz、500kHz及1MHz超声波治疗仪（上海市超声医学研究所提供，由超声波发生器、单路功放和平面换能器组成，输出功率可调，换能器头端为平面圆形，直径13mm）。
二、细胞株及培养体系
人前列腺癌PC3细胞株购自中科院上海细胞库，用25cm培养瓶、含10%胎牛血清的DMEM培养液培养，培养环境为37℃、5%二氧化碳湿化培养箱。每2d更换培养液，每2～3d传代1次。实验前取对数生长期细胞以0.25%胰蛋白酶消化后，以不含血清的DMEM培养液制成单细胞悬液，调节细胞密度约1×106/ml。细胞悬液装入体积为1.5ml、底面积直径为13mm的聚乙烯平底圆形试管中，每管装细胞液1ml，备用。
三、实验分组及相应的处理方法
1.实验分组：实验共分7组，分别为：空白对照组仅人前列腺癌PC3细胞株，不进行任何处理；质粒组每毫升细胞悬液中加入1μg质粒；脂质体组每毫升细胞悬液中加入100μl转染液；脂质体+微泡组每毫升细胞悬液中加入100μl转染液和200μl微泡。低频超声联合脂质体+微泡组每毫升细胞悬液中加入100μl转染液和200μl微泡，同时超声波辐照，依据超声辐照频率不同分3个亚组，分别为20kHz超声组、500kHz超声组和1MHz超声组。每组设6个复孔。2.转染液配置：①用不含血清的DMEM培养液稀释pEGFP质粒，静置20min；②用不含血清的DMEM培养液稀释Lipofectamine2000脂质体，静置20min；③将上述两种稀释液混匀，调节终浓度分别为质粒1μg/100μl、脂质体2.5μg/100μl，静置于室温下，孵化20min，制成基因转染液。3.超声辐照方法：室温条件下，将超声探头固定于不锈钢支架上，辐射面垂直向上，将装有细胞悬液的EP管置于超声换能器表面，EP管与换能器间涂有耦合剂，辐照细胞前先将机器预热5min；调节声功率400mW/cm2，脉冲波辐照240s，占空比1∶1。各组进行相应处理后转入12孔板中，置于二氧化碳湿化培养箱培养6h后更换为含10%胎牛血清的DMEM培养液继续培养。
四、荧光显微镜观察转染情况
各组细胞用完全培养基继续培养24h后，PBS洗去上层杂质，立即用荧光显微镜20倍视野观察。
五、流式细胞仪检测各组转染率
各组细胞用完全培养基继续培养24h后，用0.25%胰蛋白酶消化细胞，转入离心管，1000r/min，离心5min，弃上清液，将每组细胞重悬于1.5ml的DMEM培养液中，并分装入3个流式管，每管500μl，用流式细胞仪检测各组转染率。
六、统计学处理
应用SPSS13.0统计软件，转染率以x±s表示，不同组别转染率比较行方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。结果一、荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达情况携pEGFP基因的质粒转染人前列腺癌PC3细胞后，在胞质内表达合成绿色荧光蛋白。荧光显微镜下，低频超声联合脂质体+微泡组的胞质内可见大量绿色荧光蛋白表达，明显多于其他组，其中20kHz亚组表达量稍多于其他亚组；脂质体组和脂质体微泡组的绿色荧光蛋白表达量亦多于对照组和质粒组；脂质体组与脂质体微泡组、对照组与质粒组间绿色荧光蛋白表达量差异不明显。见图1。二、流式细胞仪定量检测pEGFP转染情况各组pEGFP基因转染率见表1。脂质体组和脂质体+微泡组转染率高于空白对照组和单纯质粒组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；低频超声联合脂质体+微泡组的转染率高于质粒组，其中以20kHz超声组的转染率最高，明显高于其他各组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；500kHz超声组和1MHz超声组的转染率均高于质粒组，差异有统计学意义（P<0.05），见图2，3。脂质体组与脂质体+微泡组之间转染率比较差异无统计学意义（P=0.892）；500kHz超声组与1MHz超声组转染率比较差异无统计学意义（P=0.218）。随着超声辐照频率增高，转染率存在下降趋势。
七、讨论
低频超声通常是指频率为20kHz~1MHz的超声波，热量和升温均接近于可以忽略的程度，其产生的生物学效应主要与空化作用有关［3］。近年来，研究［4］证实低频超声辐照微泡可以在瞬间小范围破坏细胞膜完整性，促进靶向药物的胞内转运和基因转染，即所谓“声孔效应”。这一发现为基因治疗提供了新思路。Zolochevska等［5］利用“声孔效应”将IL-27基因转染至三种免疫耐受的前列腺癌细胞内，对肿瘤生长、基因组表达和多种细胞因子进行了系统分析，结果证实该方法可以有效地抑制肿瘤生长，提高免疫机能。Casey等［6］也进行了相关研究，将编码GM-CSF和B7-1共刺激分子的DNA片段导入小鼠肿瘤细胞，并对辐照条件进行了优化，发现治疗效果堪比电穿孔，低频超声辐照微泡作为无创无病毒基因干扰的新方法是有效、精确且安全的。本课题组前期关于超声联合微泡可以促进脂质体介导pEGFP基因转染体外前列腺癌细胞的研究表明，同单纯的脂质体转染相比，超声加微泡联合脂质体可以明显提高基因的转染率，差异有统计学意义（P＜0.05）［7］，其相关的机制可能是超声联合微泡通过空化效应及声孔效应引起质膜穿孔、细胞膜通透性的增高。一方面，脂质体和微泡结合形成的混合物具有较高的有效载荷基因、药物等微粒的效率。另一方面，在超声作用下，微泡的爆破也可以引起微泡周围脂质体的破裂，促进包裹在脂质体里的物质释放，从而促进基因进入细胞，提高基因的转染效率［8-9］。本实验进一步证实了超声辐照可以促进质粒转染的事实，同时进一步比较研究了相同声功率条件下不同辐照频率的转染效率。超声波基础物理研究表明［10-11］，空化效应与声场声压、微泡及频率等多种因素有关。微泡的初始半径在空化泡生长和破溃过程中起重要作用。初始半径小于共振半径可以增强声空化作用，而随着频率的升高，共振半径减小。本实验所采用的最高辐照频率为1MHz，所对应的共振半径为7.5μm，而所用SonoVue半径为1.0～2.5μm，因此微泡初始半径小于最小共振半径，产生明显的空化作用。声学理论研究［12］表明，超声波频率越低，空化所需声强越小，在液体中越容易产生空化效应。本实验结果也显示，相同声功率条件下随着辐照频率增高，转染率有下降趋势。原因可用以下两点解释：首先，在相同声功率相同辐照面积条件下，声场声功率相近，低频辐照更易产生空化效应；其次，辐照频率越低，共振半径越大，相同体积微泡中小于共振半径的空化核越多，瞬态空化作用越明显［13］。本实验所采用的低频超声频率分别为20kHz、500kHz和1MHz，具有较好代表性；利用低频超声所产生的空化效应促进携带pEGFP基因的质粒进入前列腺癌细胞内，通过观察绿色荧光蛋白简便、直观地了解目的基因的表达情况；采用流式细胞仪分析各组转染率，获得客观准确的实验结果。通过定性分析与定量检测相结合的实验方法来比较不同频率低频超声的生物学效应，理论具备创新性，方法具备科学性。低频超声的空化作用强弱由多种声学条件共同决定，如何找到安全范围内促进基因转染的最佳声学条件尚有待进一步探索。近年来低频超声促进基因转染的研究备受关注，为临床疾病的治疗提供了新理念，具有广阔发展前景。综上所述，低频超声辐照微泡可显著促进脂质体介质的pEGFP质粒转染医学论文撰写人前列腺经济学癌细胞，其中20kHz效果最佳。在相同声功率、相同辐照面积下，随着辐照频率的升高，转染率呈下降趋势。
作者：张蔚 白文坤 寿文德 王玉 陈旖旎 杨雨 胡兵
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