1材料和方法
向每组样品中分别加入PCR试剂盒中各反应体系及特定位点引物。反应步骤：95℃预变性5min；94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸1min，72℃最后延伸10min，循环30次。聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)及银染法检测微卫星位点PCR扩增后产物：用30%丙烯酰胺母液及10%过硫酸铵(APS)配制12%聚丙烯酰胺凝胶，各样品上样3μL后，于垂直电泳槽中，150V电压持续电泳2h。用乙醇、冰乙酸配制成固定液，0.25%硝酸银溶液为染色液及3%氢氧化钠，0.2%甲醛配制的显色液进行银染显色反应。并用凝胶化学发光成像仪照相、分析。ABI3730XL自动测序仪对PCR扩增产物进行测序：基于sanger法，4种双脱氧核苷酸(ddNTP)的碱基分别用不同的荧光进行标记，ABI3730XL自动测序仪对待测样品进行毛细管电泳，通过毛细管时，不同长度的DNA片段上的4种荧光基团被激光激发，发出不同颜色的荧光，被CCD检测系统识别，并直接翻译成DNA序列。主要观察指标：人脐静脉内皮细胞、人皮肤成纤维细胞和10株人癌细胞在5个微卫星位点的扩增片段长度。
2结果Results
2.1人脐静脉内皮细胞和人皮肤成纤维细胞5个微卫星位点长度
人脐静脉内皮细胞和人皮肤成纤维细胞在5个位点上的PCR产物长度均一致。经测序仪测序，该2株细胞的扩增序列长度相差在1bp以内，见表2。说明人皮肤成纤维细胞，人脐静脉内皮细胞的5个微卫星位点长度具有一致性及稳定性，可作为正常对照(图1)。
2.2各株细胞的微卫星不稳定性分析
以人脐静脉内皮细胞，人皮肤成纤维细胞为正常对照，人结肠癌细胞HCT-116在BAT-25、BAT-26、CAT-25、NR-24位点扩增片段长度较人脐静脉内皮细胞及人皮肤成纤维细胞均缩短(图1A-D)，表2的测序结果显示缩短产度为7-13bp，说明HCT-116在这4个位点上显现微卫星不稳定性,属于微卫星高不稳定性细胞。而在SEC-63位点，HCT-116扩增片段长度与人脐静脉内皮细胞、人皮肤成纤维细胞持平(图1E)，片段长度仅差1bp(表2)，说明HCT-116在该微卫星位点稳定。人膀胱癌细胞BIU-87在BAT-25、BAT-26、CAT-25位点扩增片段长度均较人脐静脉内皮细胞及人皮肤成纤维细胞缩短(图1A-C)，缩短长度为8-13bp(表2)，表现为微卫星不稳定，属于微卫星高不稳定细胞。在NR-24、SEC-63位点，BIU-87扩增片段长度与人脐静脉内皮细胞、人皮肤成纤维细胞持平(图1D-E)，片段长度相似(表2)，显现微卫星稳定性。以人皮肤成纤维细胞和人脐静脉内皮细胞为正常对照，K562、SGC-7901、HepG2、A549、GLC-82、NCI-H446、Hela、EJ细胞在5个微卫星位点无扩增片段长度变化(图1)，片段长度差异在2bp以内(测序结果略)，显现微卫星稳定性。
3讨论Discussion
该标准使用单核苷酸位点：BAT-25(原癌基因c-kit内含子区的微卫星位点)和BAT-26(hMSH2第5个内含子区域的单腺苷酸重复片段)及二核苷酸位点:D5S346、D2S123、D17S250为标志位点检测微卫星不稳定性。其中BAT-25和BAT-26是单核苷酸重复序列，研究显示它们在人体细胞中保守性好，属于几近单态性(quasimonomorphic)的标志[31-32]。用它们检测微卫星的不稳定性避免了必须用同源(来自同一个体)的正常组织细胞为对照的必要性，可以用人正常细胞做对照，使得直接应用肿瘤细胞株研究微卫星不稳定性成为可能。CAT-25(位于caspase2基因的3’非翻译区)、NR-24(锌指蛋白2)和SEC-63(编码内质网膜的蛋白质)是继BAT-25和BAT-26之后，被推荐用于检测微卫星不稳定性的高敏感单态性位点[33]，BAT-25、BAT-26合并CAT-25、NR-24、SEC-63可以准确而全面地检出癌细胞的微卫星稳定状态，准确率在99%以上[34]。本实验中，2株人正常细胞株：人皮肤成纤维细胞和人脐静脉内皮细胞，在上述5个位点扩增产物几乎保持一致(扩增片段长度差异在1bp以内)，佐证了这5个位点确为几近单态性的微卫星位点。同时，研究通过比较10株人癌细胞在上述5个几近单态性微卫星位点DNA序列与2株人正常细胞的差异，测定出10株肿瘤细胞的微卫星稳定状态。微卫星位点有≥2个位点出现不稳定，定义为高频微卫星不稳定性(high-frequentMSI，MSI-H)，1个位点出现不稳定，定义为低频微卫星不稳定性(low-frequentMSI，MSI-L)，无位点不稳定时判定为微卫星稳定(microsatellitestability，MSS)。从结果可以看出，人结肠癌细胞HCT-116，在5个位点均表现出微卫星不稳定性，属于微卫星高度不稳定(MSI-H)细胞；人膀胱癌细胞BIU-87，在BAT-25、BAT-26和CAT-25三个位点表现出微卫星不稳定性，也属于微卫星高度不稳定(MSI-H)细胞；K562、SGC-7901、HepG2、A549、GLC-82、NCI-H446、Hela、EJ细胞在5个位点均表现出微卫星稳定性，属于微卫星稳定(MSS)细胞。人结肠癌细胞与人膀胱癌细胞在BAT-25、BAT-26和CAT-25三个位点均表现出不稳定性，说明BAT-25、BAT-26和CAT-25是比NR-24及SEC-63更为敏感的测定微卫星不稳定性的位点。人结肠癌细胞是高频微卫星不稳定性细胞，已有文献报道[35-36]，本研究结果与其一致。本实验发现人膀胱癌细胞BIU-87也是一株微卫星高不稳定的细胞，这与临床发现微卫星不稳定性多发于大肠癌、膀胱癌、子宫内膜癌的报道吻合[7，26]。值得一提的是，同为人膀胱癌的EJ细胞却在所测定的5个位点表现出微卫星稳定性，说明微卫星不稳定性的发生不仅与肿瘤发生的器官来源有关，还与个体的遗传背景有关，同种器官来源的肿瘤细胞株之间存在着明显的遗传差异。这种差异值得在选用人癌细胞作为实验对象时加以考虑，同时，值得对产生这种差异的原因及后果进行进一步的研究。
作者：石中正北京职称 刘山东职称燕 罗敏 陈英杰 周轶平 单位：昆明医科大学药学院暨省天然药物药理重点实验室 医科大学基础医学院
