1肝细胞形态及功能检测
对培养于24孔板中的肝细胞使用倒置相差显微镜对其形态学进行观察；将三维培养的肝细胞常规固定、石蜡包埋切片，进行HE染色、PAS染色及Alb免疫组织化学染色，免疫组化中一抗为1:800抗大鼠白蛋白抗体，二抗为1:200的小鼠抗山羊抗体。阴性对照则用PBS代替一抗，其余步骤相同。1）光镜下形态学观察；2)荧光显微镜观察：将新分离的kupffer细胞在328nm波长紫外光照射下进行观察，鉴定细胞纯度；3)免疫荧光化学染色：培养7天后进行CD68（ED-1）免疫荧光染色，后使用DAPI复染细胞核，行共聚焦显微镜下观察。采用改良的原位灌注法及多次低速离心法分离大鼠肝细胞(图1)，每只大鼠可获得1.37±0.53×108个肝细胞。经Per-coll密度梯度离心以及进一步选择性贴壁纯化kupffer细胞，可获得细胞数量为3.45±0.41×106/g肝脏。细胞存活率及纯度都可达90%。
2肝细胞形态及功能检测
2.1肝细胞形态学观察
倒置显微镜观察分离后的原代肝细胞在接种后2h就可以贴壁生长，24h后细胞完全伸展，呈铺路石样，可见肝细胞呈六边形或不规则形，排列整齐，细胞界限清晰。细胞核为单核和双核，呈圆形或椭圆形，核仁清晰可见。相邻肝细胞连接紧密，形成条索状或导状结构，见图2A。培养7天后行HE染色可见三维培养中的肝细胞呈圆形，以三维立体方式均匀分散在胶原水凝胶中，细胞核大而圆，核仁明显，为单核或双核，呈类似肝脏结构的肝索样聚集排列(图2B)。
2.2肝细胞功能检测
肝细胞三维培养7天后进行PAS染色及白蛋白免疫组化染色鉴定肝细胞功能。PAS染色后，细胞胞质中可见密集紫红色糖原颗粒(图2C)，肝细胞仍具有糖原合成能力。白蛋白免疫组化染色可见肝细胞质中有棕红色颗粒，白蛋白表达阳性(图2D)。刚分离出来的kupffer细胞，体积较小，呈球形悬浮在培养液中，折光性强。15min开始贴壁，1-2h后贴壁牢固，大部分细胞呈扁圆形，少数细胞伸出伪足。48h后所有细胞都已完全展开体积明显变大，呈星形和多角形，边界不清楚。本文来自于《现代现代生物医学进展杂志简介详见
2.3荧光倒置显微镜
首次换液后的kupffer细胞，置于328nm波长下观察没有自发荧光的情况。CD68免疫组化染色kupffer细胞培养7天后，几乎所有细胞都染成阳性，细胞呈现充分展开的不规则多边形。
3讨论
近年来，对于肝纤维化发病机制的认识逐渐深入。研究表明kupffer细胞作为肝脏损伤后的主要免疫效应细胞，通过释放细胞因子参与肝纤维化的启动和调控过程。也有报道证明肝细胞凋亡在肝纤维化过程中起重要作用[5，6]，而kupffer细胞可以吞没来自肝细胞、红细胞和中性粒细胞的吞噬小体，这些事件更加速了肝脏炎症和纤维化[7，8]。因此，kupffer细胞激活调控及肝细胞凋亡之间的关系成为肝纤维化研究的热点[9-11]。既往因受细胞分离培养技术的限制，研究仅局限于肝脏原位形态学及组织学的研究。因此，建立简便、稳定的肝细胞与kupffer细胞同步分离的方法，是肝纤维化研究的基础工作之一。单独分离肝细胞或kupffer细胞的报道较多[12-14]，但成本高且耗时耗力，并且两种细胞来源于不同的个体，研究两细胞相互作用时，难以将其控制在同一条件下。因两种细胞的特性不同，所以分离条件存在很大的差别，掌握不好极易损伤细胞。根据这些特点，本文先采用不含钙离子的Buffer1进行在体灌注，冲去肝脏组织中的血液成分，再通过含钙离子的Buffer2进一步快速灌洗肝脏，再离体灌注胶原酶获得细胞悬液。然后将肝脏灌注后获得的细胞悬液用低速离心分成两部分，沉淀部分是极易损伤的肝细胞，上清中是包括kupffer细胞、肝星状细胞等的肝非实质细胞。沉淀部分(富含肝细胞)直接清洗，低速离心减少了肝细胞的破坏。上清中富含肝非实质细胞，根据各细胞密度不同，采用percoll密度梯度离心分离纯化出kupffer细胞，再通过差速贴壁方法进一步纯化kupffer细胞。经此法分离的两种细胞，保持了良好的存活率、纯度和细胞形态及功能，为今后研究提供了快速简单的细胞获取方法。
作者：王敏 兰亚 胡皓 时论文代理永全 韩英 周新民 单位：第四军医大学西京消化病医院肿瘤生物学重点实验室 延安大学附属医院
