1.激光共聚焦显微镜
激光共聚焦显微镜在传统光学显微镜的基础上作了改进，具有除目镜与物镜之外的图片放大功能，可以随时采集和记录检测信号，观察活细胞的结构及特定分子、离子的生物学变化。其选择单色性较好的激光作为光源，从根本上消除了色差。物镜的焦平面上加了一个带孔挡板，阻挡了焦平面外的杂散光，进一步消除色差。样品被分解成二维或三维空间上的无数个点，激光束逐个扫描成像，进而组成整体的平面或立体图像，计算机代替肉眼或照相机进行观察或摄像，数字化的图像在电脑中进一步处理，提高了图像的清晰度。该仪器还使用了光电倍增管，将微弱的信号放大，大大提高了灵敏度。由于以上优点，激光共聚焦显微镜可以应用到几乎所有有关细胞研究的领域。如原位鉴定细胞或组织内的生物大分子，观察细胞或亚细胞的形态结构；无损伤实时检测分析活细胞，并研究其形态和功能；在一个样品上同时进行多重标记，实时观察等。
2荧光探针
荧光探针在荧光成像技术中占据举足轻重的地位。一般荧光探针需具备优良的光物理性质，以便于激发和检测，且不与生物基质同时被激发，还要有较高的荧光量子产率和摩尔消光系数。荧光探针的溶解度要大，便于溶于缓冲液或细胞培养液中，且热、光性质比较稳定，有特异性标记位点。荧光探针需要具有良好的生物相容性，易于进入细胞内。荧光探针大致分为两类，包括化学类和生物类。化学类包括有机染料、纳米材料（金纳米粒子、半导体量子点等）及金属配合物等。生物类包括藻胆蛋白、分子灯标及基因编码荧光蛋白等。荧光探针在化学、光学、生物学等领域应用广泛，但是，目前仍缺少有效的分子探针识别疾病分子水平上的独特位点，故从分子水平上进行病理研究比较困难。
3荧光成像技术的应用
3.1蛋白质、金属离子的检测
生物体的生理状态可以通过蛋白质表现出来，生命活动离不开各种酶的作用，而酶大多是由蛋白质构成的，故研究蛋白质的结构和功能在认识生命活动过程中至关重要。刘亭延等采用荧光成像技术构建了一种检测人血清蛋白质的新方法。该方法以碳量子点为标记染料，以聚丙烯酰胺凝胶电泳分离出人血清蛋白，优化实验条件，最终得到清晰的电泳图。段相国等建立了一种ＨＣＶＮＳ３／４Ａ蛋白酶在小鼠体内瞬间表达的模型。金属离子在生物学中起重要作用，金属离子与荧光探针结合，在荧光显微镜下可观察细胞内金属离子的变化。Ｍｉｃｈａｅｌ等选用Ｉｎｄｏ－１为模板，合成了一系列检测Ｃａ２＋的荧光探针，可用于确定活细胞中特定位置的Ｃａ２＋浓度。Ｓａｒｅ等合成了Ｚｎ２＋的荧光探针，并应用到细胞中Ｚｎ２＋的检测识别中。人们还建立了Ｍｇ、Ｃｕ、Ｈｇ、Ｃｄ等离子的检测模型。荧光成像技术应用于蛋白质及细胞内金属离子检测还存在一些问题，如有的荧光探针不能通过细胞膜、成像过程对细胞造成损害、检测方法不统一等，因此，建立统一、低损害的荧光成像检测技术仍是极具挑战性的研究课题。
3.2肿瘤疾病的检测和诊断
目前，肿瘤的临床诊断主要依赖于显微形态学观察，从而在细胞层面上了解肿瘤细胞的类型与个体差异，这就要求检测手段不断进步。荧光成像技术以其操作方便、标记靶点多、灵敏度高等优点，广泛应用于肿瘤跟踪成像研究中，具有广阔的临床应用价值。高苒等建立了一种小鼠肿瘤模型，利用荧光显微镜和活体荧光成像仪可直接从整体和细胞水平上观察肿瘤，了解宿主与肿瘤间的作用。至今为止，人们对此进行了深入的探讨和研究，但该技术应用于体内时需要考虑复杂的体内环境，动物组织会产生背景噪音，影响该技术的发展应用。
3.3药物新剂型研究
为了提高药物疗效，降低毒副作用，发展药物新剂型尤为重要。荧光探针的不断发展使荧光成像技术在这一领域的应用范围不断扩大，可用于对药物运输过程、细胞屏障跨越方式、药物释放过程等的观测研究，它的迅速发展也大大促进了药物新剂型研究的迅速发展。陈刚等研究了荧光探针经内耳给药后的转运通路，在荧光成像系统下追踪了整个运输过程。钟华等构建了一种装载抗癌药物阿霉素的新型纳米胶囊，采用激光共聚焦显微镜实时跟踪观察药物投递释放过程，为新剂型的研究提供了理论平台。目前，类似的研究虽然较多，但仍处于理论研究阶段，诸如荧光探针毒性、生物体内相容性等问题还没有解决，没有合理的规范，难以规模化生产。
4结论与展望
荧光成像技术的迅速发展加深了人们在分子水平对生命科学的了解，生命科学的研究也进一步推进了荧光成像技术的发展。激光共聚焦显微镜操作简单，应用广泛，荧光探针易于制备，荧光信号强，荧光成像技术可用于蛋白质、金属离子的检测，在肿瘤等疾病的检测中也起着重要作用，还可以实时跟踪检测给药过程，为药物新剂型的研究提供新的平台。目前，荧光成像技术仍存在许多不足，主要为：细胞在可见光区有自发荧光，掩盖了标记分子信号；难以实现对分子的长期标记检测。荧光成像技术是基础研究和实际应用间的重要纽带，三者将相互促进，不断进步。
作者：张慧 钟华 许海平 张烨轩 单位：青岛科技大学化学与分子工程学院
