结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，TB)属胞内寄生菌，感染人体后首先引发固有免疫应答反应。但大多数情况下固有免疫不足以抑制或清除TB的生长繁殖，随后固有免疫中吞噬有TB的巨噬细胞释放TB相关抗原，由抗原提呈细胞摄取、加工提呈给特异性的CD4+、CD8+及γδT细胞，产生致敏的T细胞并辅助B细胞活化产生特异的抗TB抗体，从而引发获得性免疫应答反应。TB感染的免疫学诊断技术可分两类，一为体内试验，即结核菌素皮肤试验(tuberculinskintest，TST);二是体外试验，包括TB抗原检测、抗体检测及致敏T淋巴细胞检测。其中，用于检测致敏T淋巴细胞的γ-干扰素释放试验(interferongammareleaseassay，IGＲA)是近年来结核病免疫学诊断的重要技术进展。本文着重介绍IGＲA原理及应用过程中需重点关注的各种影响因素。
1TST
TST是基于Ⅳ型变态反应原理的一种皮肤试验，又称为结核菌素纯蛋白衍生物(purifiedproteinderivativeoftuberculin，PPD)试验。感染过TB的机体会产生相应的致敏淋巴细胞，当再次遇到TB或菌体蛋白质时，致敏的淋巴细胞活化释放出多种可溶性淋巴因子，导致血管通透性增加，巨噬细胞在局部集聚、浸润。皮下注射TB抗原后48～72h内，局部出现红肿硬节，呈现变态反应阳性。该方法的不足在于不能有效区分TB的自然感染与卡介苗(BCG)接种引起的免疫反应。另外，近期感染TB(2周之内)、小儿结核、老年人结核、免疫缺陷或免疫功能低下等患者常出现假阴性结果［1］。
2TB抗原检测
TB抗原包括菌体细胞、PPD、脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)、MPT64、14kD抗原、38kD抗原、31kD抗原、Ag85复合物、热休克蛋白65(HSP65)抗原、培养滤液蛋白10(CFP-10)、早期分泌性抗原靶-6(ESAT-6)等。检测技术有ELISA、免疫斑点法、免疫金标技术、免疫荧光技术等［2］。在机体产生致敏的T细胞或抗TB抗体前即可检测到TB的多种抗原成分，因此，TB抗原是一类潜在的TB感染的早期检测指标。此外，TB抗原检测不受宿主免疫功能状态的影响，在患者免疫功能低下、不能有效产生致敏的T细胞和抗TB抗体的情况下抗原检测的优势较为明显。但TB的抗原成分极为复杂，还存在较多的交叉抗原，目前具有明确诊断价值的TB抗原仍较少，因此，在一定程度上限制了其临床应用。
3抗TB抗体检测
TB的各种抗原成分可刺激机体产生多种特异性的抗TB抗体，因此，应用TB抗原检测患者血清或其他体液中的抗TB抗体也是结核病的辅助诊断方法之一。早期用于抗TB抗体检测的抗原是包含有细菌蛋白质、糖脂和多糖的混合抗原，通常通过制备细胞裂解产物或培养物加热过滤液获得。现在通过基因工程技术进行表达和纯化，可大量制备TB蛋白质成分作为检测用抗原。以后还可以应用基因工程技术对TB抗原进行改造，制备出高抗原性而低交叉反应性的TB检测抗原。常用的TB抗体检测方法包括结明实验(MycoDot)、ELISA、免疫斑点实验(Dot-Iba)、斑点免疫渗滤试验(DIGFA)、斑点免疫层析试验(DICA)、免疫印迹试验(westernblot)、蛋白质芯片技术等，对菌阴肺结核及不易取得细菌学检查标本的肺外结核、儿童结核病等的诊断有一定的参考价值［3-4］。与HBV、HCV、HIV和梅毒等不同的是，TB具有独特而复杂的感染免疫特点。此外，还存在年龄、检测的抗体类型(IgG、IgM、IgA)、结核病感染的类型及BCG的广泛接种等多种因素的影响，使得血清学抗体检测在结核诊断中面临诸多的困难和挑战。多种抗原和抗体联合检测有助于提高检测的敏感性。
4IGＲA
4．1检测原理机体感染TB后产生抗原特异性的致敏T淋巴细胞，后者长期存在于血循环中，当再次接触TB特异性抗原时，能迅速活化增殖，释放γ-干扰素。根据这一机制，抽取患者外周全血或制备单个核细胞悬液，加入特异性的TB抗原进行培养，通过检测培养上清中的γ-干扰素水平的变化来判断有无TB感染，此类试验为IGＲA。IGＲA是新一代TB血液免疫学诊断技术。有多种商品化的IGＲA试剂盒可供选择。表1列出了目前国外4种主要IGＲA试剂盒，按照γ-干扰素的测定方法可分为两类，一类是采用ELISA检测γ-干扰素，而另一种是使用酶联免疫斑点技术(enzyme-linkedimmunospot，ELISPOT)检测［5］。另外我国北京、上海、广州、武汉等地厂家生产的IGＲA试剂盒已获得国家食品药品监督管理总局(CFDA)批准，同样也分ELISA和ELISPOT两类。2015年，凯杰公司推出了获得欧盟CE-IVD认证的第4代检测试剂QuantiFEＲON-TBGoldPlus(QFT-Plus)，并已在欧洲等地上市。4．2IGＲA用于TB诊断的优点和不足IGＲA用于TB诊断的优点有:(1)所用刺激抗原ESAT-6、CFP-10或TB7．7在BCG中缺失，因此，避免了前期BCG接种引起的交叉反应;(2)所用刺激抗原只存在于结核分枝杆菌群(包括人型分枝杆菌，牛型分枝杆菌和非洲型分枝杆菌)及其他少数几种致病性分枝杆菌，如堪萨斯分枝杆菌、Szulgai分枝杆菌及海分枝杆菌中，因此，与其他大多数环境分枝杆菌的交叉反应较少;(3)特异性优于TST;(4)大多数文献报道IGＲA敏感性不低于TST;(5)试剂盒设有阳性对照和空白对照，结果判断主观因素少。不足之处在于:(1)对实验室设备要求较高，需进行细胞培养，操作步骤较多，重复性欠佳;(2)检测标本要求为新鲜血液标本;(3)与TST一样，IGＲA不能区分活动性结核和潜伏性结核，也不能判断TB感染后是否会发展为活动性结核病;(4)常出现不确定结果，尤其是免疫功能不全患者;(5)检测费用昂贵［6-7］。4．3检测准确性的影响因素在实际应用过程中，从事检测操作的工作人员以及临床医生必须充分了解影响检测结果的各种因素。影响检测结果准确性的因素有以下几方面。4．3．1试剂盒性能IGＲA试剂的质量直接影响到最终检测结果。一方面试剂盒内在的因素，即本身设计存在各自的优缺点，如目前主流的两类试剂盒中刺激抗原不同，最终检测γ-干扰素的方法也不同。另一方面试剂盒在运输或使用过程没有遵照试剂盒的要求，如温度、混匀方式等，这些也会对检测结果产生影响。在首次建立IGＲA方法时，实验室应进行必要的性能验证。尽管目前没有成熟的IGＲA性能验证指标，但至少应包含重复性、准确性、cutoff值，其中，准确性可采用痰涂片和培养阳性患者血标本进行验证。在标准操作程序(standardoperationprocedure，SOP)文件中对出现不确定结果时如何进行结果解释或进一步操作也应有明确的说明。平时检测过程中注意监测阳性率和不确定结果的比例，通常可以发现试剂盒性能的偏倚［8-9］。4．3．2分析前因素有多种分析前因素对IGＲA检测结果产生重要影响，其中研究较多的是标本运送延迟，即从血液标本采集运送到实验室并与刺激抗原温育这一时间段延长，QFT法允许的时间为16h以内。但Doberne等［10］发现，与立即培养相比，延迟6h或12h时阳性转阴性的比例可分别达19%和22%;运送延迟还会使得阳性对照结果降低，并可出现较多的不确定结果。其他影响因素还包括共培养的血液量、混匀方式、温育时间。血液用量增多会降低γ-干扰素水平从而阳性率降低。剧烈振荡或延长温育时间会提高阳性率。另外，血液标本采集时间(早晨或晚上)对结果也会产生影响，但目前机制仍不清楚［11］。4．3．3分析中因素主要包括生物标本中的物质对结果的干扰、加样不准确、错误的离心和洗涤操作，以及检测γ-干扰素时对结果的判读不准。这些因素不同于分析前影响因素，常常是随机产生，难以完全消除，可导致较大的批内和批间变异［12］。因此，在实际操作中，每批次实验均需按要求设立阳性对照和空白对照组。实验操作人员也要加强操作培训，尤其在进行T-SPOT．TB检测时，以减少人员间的结果变异。4．3．4患者机体免疫状态患者在接受TST试验3d后，无论是用QFT或T-SPOT．TB再次检测均会发现血液细胞对刺激抗原的应答反应显著增加，表现为产生的γ-干扰素显著增加。其可能在于TST试验中注射的PPD复合抗原已先期激发了体内记忆性T细胞，当在体外再次加以抗原刺激时，特异性T细胞充分活化并释放γ-干扰素［13］。当然，也要考虑到检测对象是否为合并HIV、肿瘤、儿童或其他免疫功能不全或免疫功能低下患者。4．4IGＲA检测的质量控制IGＲA在国外已临床运用多年，并且入选了一些发达国家的结核病防治指南，被作为结核分枝杆菌感染检测的重要手段之一。但目前报道的IGＲA用于诊断结核病的敏感性、特异性差异较大，其性能在我国并没有进行多中心大样本的评估，试剂盒说明书提供的结果判读标准是否适合中国人尚需进一步验证。各检测实验室还需充分探索如何开展该技术的性能验证及室内质量控制工作。行业主管部门需积极引导并研究如何做好室间质量评价工作，对检测操作及结果分析解释等方面能进行规范化培训，确保该技术在临床应用中得到规范有序的发展。
5结语
结核病的免疫学诊断技术近年发展迅速，只有充分了解每一种检测技术的优缺点和各类影响因素，才能做到合理应用。IGＲA作为一种新型结核病免疫诊断技术，在认真做好质量控制并进一步降低检测费用的前提下，值得作为一种医学检验适宜技术推广应用。
作者：王文红 许秋桂 焦志军 单位：江苏大学附属医院检验科 镇江市医学免疫学重点实验室
相关专题：中国企业海外并购案例 大氮肥 宁波
