０引言
索骨丹，又名鬼灯檠、老蛇盘，牛角七，秤杆七等，为虎耳草科（Ｓａｘｉｆｒａｇａｃｅａｅ）鬼灯檠属（犚狅犱犵犲狉狊犻犪）植物老蛇盘犚狅犱犵犲狉狊犻犪犪犲狊犮狌犾犻犳狅犾犻犪Ｂａｔａｌ．的根状茎，分布于秦岭山区，味苦、涩，性平，具消肿解毒、收敛止血、活血生肌等功效，当地常用于治疗肺热咳嗽、咽喉疼痛、久泻、痢疾、咯血、吐血便血、湿热黄疸、崩漏、跌打损伤以及风湿等症［１］，治疗范围广泛。所含化学成分包括多糖、黄酮、蒽醌、鞣质及岩白菜素等［２～４］。尽管该药具有诸多药效，但主要局限于秦岭当地使用。过氧化物质是生物细胞在代谢过程中所产生的一类物质，包括超氧阴离子、羟自由基等。由于其含有一个或者多个未成对电子，所以化学性质很活泼，具有很强的反应性［５，６］。抗氧化剂可通过释放一个能够与自由基配对的电子，从而抑制过度氧化。乳腺癌是主要威胁女性健康及生命的恶性肿瘤，寻求既具有治疗作用，又对患者身体伤害小的天然药物是目前关注的一个方向［７］。为开发秦岭药材，探讨索骨丹的治疗机制，本文就索骨丹提取物对超氧阴离子的清除及对乳腺癌细胞生长繁殖的抑制进行了探讨，以期为索骨丹的深入开发提供实验依据。
１材料与方法
１．１材料与仪器
索骨丹，购自太白山，经陕西中医学院胡本祥教授鉴定。人乳腺癌细胞ＭＣＦ７（武汉博士德生物工程有限公司）；ＲＰＭＩ１６４０培养基，胎牛血清（赛默飞世尔生物化学制品（北京）有限公司）；胰蛋白酶（ＳｏｌｏｎＩｎｄ．Ｐｋｗｙ）；四噻唑蓝（阿拉丁试剂（上海）有限公司）；邻苯三酚，三（羟甲基）氨基甲烷（上海青析化工科技有限公司）；ＳＷＣＪ２Ｄ净化工作台（苏州净化设备有限公司）；ＧａｌａｘｙＣＯ２培养箱（德国Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ公司）；ＰｏｗｅｒＷａｖｅＸＳ２连续波长酶标仪（美国ＢｉｏＴｅｋ公司）；ＡｄｖａｎｔａｇｅＡ１０超纯水器（美国ＭｅｒｃｋＭｉｌｌｉｐｏｒｅ公司）。７５２Ｎ可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）；离心机（上海常思工贸有限公司）。１．２实验方法１．２．１索骨丹提取物对超氧阴离子清除能力的测定取大试管若干支，依次加入０．１ｍｏｌ•Ｌ－１ＴｒｉｓＨＣｌ缓冲液３．６ｍＬ（ｐＨ８．２），蒸馏水３ｍＬ和不同浓度的提取物样品溶液１ｍＬ（索骨丹水提取物、索骨丹蒽醌、索骨丹鞣质的浓度均分别为０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０ｍｇ•ｍＬ－１），２５℃水浴保温２０ｍｉｎ，再加入同样预热的３ｍｍｏｌ•Ｌ－１邻苯三酚溶液０．２ｍＬ，立即混匀，均匀倒入３只比色皿中，以磷酸盐缓冲液为参比，测定其在３４５ｎｍ处的吸光度，每种样品平行作３份，取均值，通过公式计算清除率。同时设不加样品的空白管，为了避免样品对吸光度的干扰，同时测定并扣除样品本体的吸光度值。１．２．２细胞培养将乳腺癌细胞ＭＣＦ７加入含１０％胎牛血清的ＲＰＭＩ１６４０培养基中，于３７℃、５％ＣＯ２及饱和湿度的培养箱内培养，２～３ｄ换液并传代１次，取第３～１０代细胞进行实验。
１．２ＭＴＴ法检测抑制率
调整细胞悬液浓度至每２００μＬ１０３～１０４个细胞，取９６孔培养板，每孔接种细胞悬液２００μＬ，再加入不同浓度的索骨丹乙酸乙酯提取物和索骨丹蒽醌５０μＬ，药物终浓度分别为４、２、１、０．、０．２５ｍｇ•ｍＬ－１，另设不加药物的空白组和加入５氟尿嘧啶（５Ｆｕ）的对照组，在３７℃、５％ＣＯ２培养箱中培养，分别于２４、４８、７２ｈ取出９６孔板，每孔加入５ｍｇ•ｍＬ－１ＭＴＴ２０μＬ后，继续３７℃培养４ｈ，取出弃去各孔内上清液，每孔加入二甲基亚砜１５０μＬ，震荡１０ｍｉｎ，用酶标仪在波长４９０ｎｍ处测定吸光度值，每个样品平行设３个复孔，实验重复３次，取均值，按公式计算药物对细胞生长的抑制率。
２结果与讨论
２．１索骨丹提取物对超氧阴离子的清除作用
由图１可知，索骨丹３种提取物对超氧阴离子均有很好的清除作用。清除率都是随着提取物浓度的增加而升高。其中鞣质和蒽醌的清除作用接近，当浓度为０．５ｍｇ•ｍＬ－１时，清除率分别为３５％和４２％，之后随着浓度的变化清除率迅速增加；当浓度为２ｍｇ•ｍＬ－１时，清除率分别达８３％和８７．３％，当浓度为３ｍｇ•ｍＬ－１时，清除率最高，分别为８６．１％和９１．７％。水提物的清除作用相对较弱，当浓度为０．５ｍｇ•ｍＬ－１时，清除率仅为２１．２％，清除率在浓度为３ｍｇ•ｍＬ－１时达最大，为８０．２％。
２．２索骨丹提取物对乳腺癌细胞的抑制作用
由表１和表２可知，索骨丹乙酸乙酯提取物对乳腺癌细胞的抑制率在３个时间段具有显著的差别，在作用了２４ｈ后，仅４、２、１、０．５ｍｇ•ｍＬ－１具有弱的抑制作用，经４８ｈ后，各个浓度的抑制作用均明显增强，但抑制作用的强弱与浓度无明显相关关系，浓度为１ｍｇ•ｍＬ－１时抑制率为５７．９％，而对照组５Ｆｕ为６９．１％，经过７２ｈ后，各浓度抑制率均有所变化，低浓度组较高浓度组抑制率高，４ｍｇ•ｍＬ－１组为４３．８％，而０．５ｍｇ•ｍＬ－１组和０．２５ｍｇ•ｍＬ－１组则分别为６６．４％和６７．７％，接近５Ｆｕ组的７１．６％，其原因之一可能是高浓度组中杂质含量较多。表２中蒽醌各个浓度组在３个时间段的抑制率均不高，在２４ｈ仅有微弱的作用，经过４８及７２ｈ后，抑制率虽有所提高，但仅个别组超过５０％。比较表１和表２，其抑制作用的强弱可能与提取物的极性有关，本实验室提取蒽醌以６０％乙醇为溶剂，６０％乙醇明显比乙酸乙酯极性大，由此推断，索骨丹中极性小的成分可能较极性大的成分作用强。
３讨论
乳腺疾病是妇女的常见病、多发病，乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，威胁着妇女的健康和生命。近年来，中国女性乳腺癌的发病率、死亡率和患病率呈持续增长趋势，并且发病年龄有年轻化的趋势，乳腺癌发病率已跃居女性恶性肿瘤的首位或第二位，且是导致女性死亡的主要原因之一［８～１０］。目前，对乳腺癌的治疗尽管已开始进入综合治疗时代，但仍是以外科手术及化学药物治疗为主。然而手术和化疗并非适合于每一位患者，寻找有效且副作用小的天然药物对乳腺癌的预防和治疗具有重要意义。索骨丹为秦岭山中的天然药物，民间应用历史悠久，治疗范围广，毒副作用小，但对其治疗作用的实验依据目前尚为欠缺。本实验发现，索骨丹对乳腺癌细胞的生长繁殖具有良好的抑制作用，同时发现索骨丹水提物、索骨丹蒽醌及索骨丹鞣质均可不同程度地抑制超氧阴离子的生成，在发挥治疗作用的同时也对机体产生了很好的保护作用。就索骨丹抑制乳腺公路机电论文癌细胞的具体作用机制将在之后的工作中进行进一步探讨。
作者：王晓梅 赵卫星 韩晓东 罗燕平 孙静 王永莉 单位：宝鸡文理学院 化学化工学院
