1种质资源的遗传多样性及鉴别
铁皮石斛苗期与石斛属有些品种在形态特征上有相似性，特别是涉及到种内遗传差异时，利用传统的鉴别方法往往不易区分。ＲAPD［12］、AFLP［13－14］、SSＲ［15］、ISSＲ［16－17］等分子标记技术目前被广泛用于铁皮石斛不同野生居群、不同栽培群体的遗传多样性及亲缘关系的研究。采用ＲAPD技术进行基因组DNA多态性分析，能从石斛属内26个种当中方便快捷地鉴别出铁皮石斛［12］。Ding等［18］利用SＲAP标记分析铁皮石斛9个居群共84份材料的遗传多样性，并进行聚类分析，结果表明原位保存是保证铁皮石斛遗传多样性的首选方法;采用ＲAPD和ISSＲ分析9个铁皮石斛自然居群，表明居群间的遗传差异明显，具有丰富的遗传多样性，并且ISSＲ的多样性检测优于ＲAPD［19］。谢明璐等［15］利用开发的SSＲ标记成功对铁皮石斛种质纯度进行鉴定。金波等［20］将扩增获得的铁皮石斛特异ＲAPD分子标记片段，经克隆、测序，重新设计一对特异性引物转化成稳定的SCAＲ标记，能特异性地在铁皮石斛中扩增出300bp的片段，实现铁皮石斛的快速有效鉴定。Hou等［21］利用15个新的三核苷酸微卫星标记能够简便快捷地对铁皮石斛进行遗传多样性鉴定和分析。建立DNA指纹图谱，有利于鉴定和筛选铁皮石斛优良品种。虞泓等［22］用AFLP技术对石斛属内4个品种和1个外类群种进行基因组DNA多态性分析，构建了药用石斛的DNA分子指纹图谱。为更准确地进行铁皮石斛种质鉴定、遗传图谱构建、基因定位和遗传多样性的分析，赵瑞强等［23］采用正交设计和单因素相结合的方法构建和优化铁皮石斛SCoT-PCＲ反应体系，在32份铁皮石斛材料的遗传多样性验证中表现出良好的稳定性和重复性。基因芯片从遗传的角度鉴别铁皮石斛品种真伪，进一步推动了铁皮石斛的遗传分析和鉴别。Sze等［24］利用5SrDNA的基因间隔区的不同，建立了高通量鉴定商业石斛(枫斗石斛)的基因芯片，可以对铁皮石斛与其他种类的石斛进行有效区分。基因芯片与中药化学成分指纹图谱等的鉴定相结合，能确定铁皮石斛药用价值的优劣，发挥最佳作用［25］。
2组织培养
铁皮石斛种子自然状态下萌发率极低，利用组织培养进行铁皮石斛人工快繁是解决铁皮石斛野生资源短缺的有效途径，已有大量石斛组织培养条件的研究报道，目前铁皮石斛试管苗已进入商品化生产。2.1外植体铁皮石斛组织培养外植体来源广泛，一般采用野生铁皮石斛种子［26－29］、根尖［30－31］、茎段［32－34］、腋芽［35］等作为外植体。应用最早和最广泛的外植体是无菌种子，在离体培养条件下，种子萌发后形成原球茎，原球茎可以直接发育形成幼苗，也可以诱导原球茎产生大量愈伤组织，由愈伤组织再分化发育成幼苗［36－37］。唐桂香等［26］以成熟的铁皮石斛种子为材料，以1/2MS为基本培养基并添加20%马铃薯液，种胚萌发率达到79.35%，并能成功诱导出原球茎。杜刚等［27］以铁皮石斛种子为外植体，通过组织培养获得大量种苗。秦廷豪等［31］用铁皮石斛茎段、带顶芽的茎段和根蔸3类外植体在MS培养基上进行诱导培养，发现仅根蔸能诱导出原球茎。王丽萍等［32］和李泽生等［34］分别以MS和1/2MS为基本培养基，选用铁皮石斛幼嫩茎段为外植体能够高效诱导出原球茎。张红梅等［33］以铁皮石斛茎段为外植体材料，经历芽诱导、丛生芽增殖和生根培养3个阶段，获得大量的试管苗，芽诱导率达到86.7%。2.2基本培养基选择合适的培养基是组织培养最关键的一步，针对培养目的、培养途径、培养阶段的不同，所使用的培养基也不同。铁皮石斛组织培养采用的基本培养基包括MS，1/2MS，N6以及相应的改良培养基等［37］。最适培养基的选择主要根据不同外植体来源和不同生长阶段决定。以铁皮石斛种胚作为培养材料，研究发现未经改良的N6培养基对胚的萌发和生长最好，以茎尖作为培养材料，N6培养基诱导愈伤组织能力明显不如MS［38－39］。以铁皮石斛茎段为材料诱导丛生芽，1/2MS诱导的效果最好，生成的苗粗壮［40］。鲍腾飞等［41］的研究表明1/2MS最有利于铁皮石斛类原球茎的生长增殖。王春等［42］以1/2MS+1.0mg·L－1BA+0.5mg·L－1NAA培养基诱导铁皮石斛原球茎，诱导率达到58%。铁皮石斛不同生长阶段的最适培养基也有较大差异。1/2MS、MS和Kc等培养基都适合原球茎的增殖，而B5和1/2MS较适宜铁皮石斛的壮苗培养［43］。2.3培养条件除基本培养基之外，包括外源激素、附加物、蔗糖、pH值、温度和光照等培养条件对不同阶段铁皮石斛生长分化均有影响。铁皮石斛组织培养中常使用的外源激素主要是生长素类(如IAA、IBA、NAA)和细胞分裂素类(如BA、ZT和KT)［44］。苏钛等［45］的研究表明，BA相对于其他激素对铁皮石斛原球茎诱导效果最好，以2.0mg·L－1BA诱导率最高。洪森荣等［46］探讨6－BA和2，4－D对铁皮石斛原球茎增殖和分化的影响时发现，添加1mg·L－16－BA和0.1mg·L－12，4－D对原球茎增殖效果较好。唐桂香等［26］的研究表明，0.5mg·L－1NAA对铁皮石斛的生根效果最好。李璐等［47］比较了6－BA和TDZ对铁皮石斛花芽诱导的影响，结果表明，0.2mg·L－1TDZ最适宜诱导其开花。宋顺等［48］以MS为基本培养基，发现添加0.5mg·L－16－BA和1.5mg·L－1NAA最适合铁皮石斛原球茎诱导，其诱导率为95%;而添加1mg·L－16－BA和1mg·L－1NAA最适合原球茎增殖;添加5mg·L－16－BA+1mg·L－1NAA最适合原球茎分化，其分化率达80%;而在根诱导的培养基中添加1.5mg·L－1IBA+100g·L－1香蕉泥，其生根率能达到100%。一些有机添加物对铁皮石斛种子萌发、芽增殖、组培苗壮苗具有一定的促进作用，已报道的有马铃薯泥［49－50］、香蕉泥［49］、苹果汁［51］等，使用浓度一般在10%～20%。培养基的pH值、温度、光照强度和时间均对铁皮石斛生长有明显的影响。陈青青等［52］研究表明，pH对铁皮石斛的苗鲜重和生根率影响显著，以pH值5.4为宜，其原因可能是pH影响细胞的透性、代谢和培养物的生长与分化，在25℃、光照强度为1500lx时，最适宜铁皮石斛生长。鲍顺淑等［53］的研究表明，在人工光型密闭式植物工厂的可控环境条件下，在光照强度和CO2浓度一定时，光照时间控制在12h/d，铁皮石斛组培苗的净光合速率和叶绿素含量较高，干重和腋芽数增加较多，表现出良好的生长与繁殖能力。
3诱变育种
铁皮石斛生长相对缓慢，一般2～3年才能采收，对现有品种进行遗传改良，培育生长迅速、药用有效成分含量高的新品种是提高产量及质量的有效途径。诱变育种突变频率高，诱发变异较易稳定，可有效改良作物性状，缩短育种年限［54］。物理及化学诱变是常采用的方法，辐射诱变结合组织培养，能加速变异性状的稳定和新品种的育成。詹忠根等［55］利用137Csγ射线辐照铁皮石斛种胚原球茎，针对形态变异的试管苗，采用流式细胞分析DNA的倍性变化，结果发现大部分外部形态发生改变的植株其细胞内DNA的倍性发生了改变。洪萨丽等［56］利用60Co-γ辐照霍山石斛原球茎，研究诱变对石斛生长和生物碱积累的影响，结果表明适当剂量的60Co-γ辐照处理可促进POD、SOD、CAT和PAL酶活性，抑制PPO酶活性，从而能促进石斛原球茎生长，提高悬浮培养原球茎生物碱含量。张青华等［57］采用0.09%秋水仙碱处理24h诱导铁皮石斛丛生芽变异率达到48%，对叶、气孔、染色体的检测，证明变异芽为四倍体或嵌合体。2.5g·L－1植酸能促进石斛多糖的合成，还能促进石斛对碳、氮、磷的吸收［58］。太空诱变育种在中药材品种培育和改良中应用广泛，目前已有数十个审(认)定的中药材品种是通过太空诱变获得的。经航天诱变的仙斛1号铁皮石斛已经通过浙江省非主要农作物品种审定委员会认定。太空诱变技术在有效创造特异突变基因资源和培育作物新品种方面已经显示出重要的作用，成为空间生命科学研究的重要组成部分［59］。利用太空诱变培育突破性优良品种方面具有的独特优势，使今后获得更多优良铁皮石斛新品种成为可能。
4基因工程
4.1基因克隆铁皮石斛的药用有效成分为生物碱、石斛多糖等植物次生代谢产物，这些次生代谢产物需要经过复杂的代谢途径最终合成，并受代谢的关键酶与限速酶调控，如转移酶、合成酶、环化酶等。对关键酶基因进行克隆和分析，是研究铁皮石斛药用有效成分代谢途径及相关分子机制的重点，也是培养优质铁皮石斛新品种的基础。樊洪泓［60］克隆了石斛生物碱合成途径中的关键基因法呢基焦磷酸合酶基因(FPS)的片段，并进行序列分析。为研究铁皮石斛多糖合成与蔗糖合成酶活性关系及表达调控，孟衡玲等［61］成功克隆了铁皮石斛蔗糖合成酶基因(DOSS1)并对其表达分析。曾淑华等［62］对克隆的铁皮石斛磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(pepc)进行表达分析发现，pepc基因在F型铁皮石斛中的表达量为H型的5.55倍。植物凝集素如甘露糖结合凝集素与植物抗病虫害密切相关。铁皮石斛在自然条件下很少发生病虫害，为探究其病虫害抗性与兰科植物凝集素之间的内在关系，Chen等［63］提取铁皮石斛叶片的ＲNA，根据兰科植物凝集素保守序列区设计引物，通过ＲACE技术克隆得到全长768bp的铁皮石斛甘露糖结合凝集素基因(DOA)，包含1个498bp的开放阅读框，其编码的165个氨基酸为凝集素前体。半定量ＲT-PCＲ分析表明，DOA基因是一个组成型表达基因，在根、茎、叶中均有表达，在茎中表达量最高，可能与铁皮石斛茎的病虫害抗性密切相关。铁皮石斛自然状态下种子萌发需要真菌共生，生长阶段也常伴有共生真菌。钙依赖蛋白激酶(calcium-dependentproteinkinases，CDPKs)以及促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinase，MAPK)及其级联途径在从枝菌根、根瘤菌－宿主植物共生体系中起重要调控作用。张岗等［64－65］从小菇真菌(Mycenasp．)侵染的铁皮石斛根中分别克隆了一个受菌根真菌诱导的铁皮石斛钙依赖蛋白激酶基因(DoCPK1)和促分裂原活化蛋白激酶基因(DoMPK1)，在小菇真菌侵染30d的石斛根中，DoCPK1和DoMPK1基因表达均显著上调，分别达到对照根中的5.16倍和7.91倍，表明DoCPK1和DoMPK1基因参与小菇真菌和铁皮石斛菌根早期互作，可能在该共生体系中起作用。4.2遗传转化目前，铁皮石斛的遗传转化最常用的方法是农杆菌介导法和基因枪法。根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)介导遗传转化关键时期为共培养阶段。Yu等［66］构建了含β－葡萄糖苷酸酶基因(GUS)的表达载体，以潮霉素磷酸转移酶基因(Hpt)筛选标记，将类原球茎与农杆菌在无抗生素的培养基上共培养3d，光照16h·d－1，再转移至添加50mg·L－1羧苄青霉素的培养基上继续培养3～4周，之后在含200mg·L－1卡拉霉素的培养基上选择培养6～8周得到转基因植株。GUS组织化学检测和Southern杂交证明GUS基因成功表达。基因枪法在石斛转基因中应用更多。Kuchnle等［67］采用微粒轰击法将Nos-NPTII基因和番木瓜病毒(PＲV)外壳蛋白基因(CP)一起导入杂种石斛的原球茎。经过卡那霉素选择培养，PCＲ分析表明，13株抗性植株带有NosNPT基因，其中有1株带有PＲVCP基因。Chia等［68］成功将荧光素酶基因(Luc)通过基因枪法导入石斛类原球茎并获得再生植株。Yu等［66］进一步发展了一个高频再生、高效而稳定表达的转化体系。以潮霉素磷酸转移酶基因HPT为筛选标记，50mg·L－1浓度下就能完全抑制非转化的杂种石斛原球茎生长。杨雪飞等［71］利用基因枪法将来源于大麦(HordeumvulgareL．)的抗旱耐盐基因lea3导入铁皮石斛的类原球茎中，经PPT筛选和生根壮苗培养获得转化植株。对转化植株进行除草剂PPT叶片涂抹检测和lea3基因的PCＲ检测，结果表明lea3基因已整合到6个株系7株铁皮石斛转化植株基因组中，转化频率为1.05%。与对照相比，获得的转lea3基因植株的耐盐胁迫能力明显增强。铁皮石斛转基因植株的遗传特性可以稳定表达，这为利用转基因技术进行铁皮石斛优良新品种培育奠定了基础。
5展望
铁皮石斛药用价值极高，但由于较长时期缺乏保护和发展，加上生态环境破坏，近年来野生资源数量急剧下降。铁皮石斛行业标准已于2012年制定，但是，宣传和贯彻落实力度不够，铁皮石斛产业和市场仍然比较混乱。不少研究者对铁皮石斛的遗传多样性进行分析，克隆铁皮石斛代谢途径中的一些关键基因，对其遗传转化技术作了探索，但分子生物学等基础研究整体相对滞后。今后应从以下几方面开展工作:首先，应该积极推进行业标准的贯彻落实。其次，加强种质资源保护和鉴定，建立种质资源的分子遗传图谱和可追溯的原始档案，为高产优质新品种选育提供理论依据。创新和优化组织培养技术，缩短培养周期，降低生产成本，建立标准化培养和生产技术体系，为其规模化生产奠定基础，从而解决资源短缺问题。此外，加强铁皮石斛的基础研究工作，发掘特异和优良基因资源，利用基因工程技术为育种提供新的途径，为铁皮石斛产业发展探求新的道路。
作者：张志勇 齐泽民 黄作喜 单位：内江师范学院生命科学学院 四川省高校特色农业资源研究与利用重点实验室
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