1菌株分离纯化
获得足够多的微生物种类和数量是有效筛选产油微生物的前提。那么，从外界环境中高效分离纯化微生物显得非常重要，但有同学不能有效地进行实施。就分离产油真菌而言，透气性好、富含有机质的偏酸性土壤中真菌较多，而有的学生却随意从校园一角采土样进行菌株分离，影响分离所得微生物种类和数量;也有学生在分离过程中，选用的培养基中不添加抗生素(如链霉素或氯霉素等)和孟加拉红，致使细菌、放线菌和真菌交织生长在一起，不利于后续菌株纯化。此外，还有学生在筛选到菌株后，仅从菌落形态方面简单判断后就将类似菌株丢弃，人为地降低了所得微生物的丰度。
2产油菌株筛选
学生通过查阅文献不难发现产油微生物筛选常用的方法是脂肪粒计数法。该方法是使用70%苏丹黑乙醇溶液将细胞内的脂肪粒氧化成蓝黑色，细胞质经过0．5%蕃红复染后成红色，显微镜下统计脂肪粒数而进行初筛［4］。但有学生在实验前期没有筛选到产油微生物，了解得知学生初筛时间存在问题。初筛时间过早，会造成一些油脂积累缓慢的微生物漏筛，但菌株培养时间过长也会造成产油优势菌株细胞内的脂肪粒重叠而产生误差。
3产油菌株鉴定
当前微生物一般采用多相分类鉴定。为了保证毕业论文质量，开阔学生视野，要求学生同时利用形态学观察与生理生化特征等经典方法和现代分子生物学手段对所分离得到的产油微生物进行分类鉴定。经典鉴定方法中，产油霉菌以形态特征为主要指标，产油酵母则形态特征和生理生化指标兼用;分子生物学方法采用通用引物ITS1和ITS4扩增其ITS1-5．8S-ITS4保守序列，后扩增产物送上海生工生物工程有限公司进行纯化测序;测序结果提交到NCBIGenBank中Blast，获得同源性较高菌株ITS序列，先利用ClustalX进行多重比对，再用Mega5．0构建NJ系统进化树，综合形态和生理生化特征，确定产油菌株的分类地位。4期马博:生物技术专业本科毕业论文实验的探索与实践111实践证明，经典鉴定方法繁琐耗时，而分子生物学方法简单便捷，但实验技能要求较高，其关键步骤是高质量基因组制备和PCＲ扩增条件优化。微生物基因组质量好坏直接影响后续PCＲ扩增实验。虽然多数学生提取的基因组能够满足PCＲ扩增要求，但琼脂糖凝胶电泳的结果显示都存在不同程度的弥散拖尾现象，表明制备的基因组有降解或含有ＲNA、多糖及蛋白质等杂质。那么，基因组DNA提取过程中应该注意哪些呢?一是在水浴保温期间，摇动不能太剧烈，以防基因组DNA断裂;二是用等体积氯仿/异戊醇抽提时，上清液应无色，且EP管中的有机相与水相交界处无明显的杂质，否则应重复抽提。另外，还应在DNA提取溶液中加入1μg/LＲNase，以除去ＲNA，提高基因组质量。PCＲ扩增实验精微，需要格外细心。如微量移液器的使用方法和PCＲ体系中各种药品的添加顺序都会对实验结果产生重要影响，应及时对学生进行指导。此外，退火温度是PCＲ扩增实验关键反应条件之一。退火温度过低会导致PCＲ产物杂带过度，退火温度过高又扩增不到目的片段。指导教师详细讲解PCＲ扩增实验原理之后，学生掌握了PCＲ扩增实验方法和注意事项。通过多次实验，最终确定了所使用引物的退火温度，产油霉菌和产油酵母分别为56℃和54℃。
4结论
经过论文选题、实验方案设计及实验实施等环节的教学及指导，系统、科学地训练了学生的实验技能，锻炼了学生动手能力、创新思维、综合分析和解决问题的能力，也培养了学生的团队协作精神。以“产油微生物的分离与鉴定”为题，涉及到微生物学、生物化学及分子生物学等学科理论知识和实验技能，能够较为全面地多层次考察学生;而大多数学生能够在有限的时间内较好地完成毕业论文，说明该论题难度适当，比较适合作为本科毕业论文题目。此外，学生筛选到高产、稳定的优势产油菌株，可通过进一步定向遗传改造应用于工业生产，将会带来良好的经济效益，实现产学研的有机结合。
作者：马博 单位：百色学院
