1材料与方法
1.1材料
本课题经我院医学伦理委员会批准审核后开展。收集2013年10月至2014年10月间于我院泌尿外科行手术切除并经病理证实的前列腺癌及对应癌旁组织(距手术切缘＞2cm)标本43例，平均年龄(67.1±2.3)岁。所有入组患者术前均未接受放化疗。标本于离体30min内取材两份，分别置于液氮或4%多聚甲醛溶液中保存;miRNA逆转录试剂盒RevertAidTMFirstStrandcDNASynthesisKit购自美国Fermentas公司;RNAisoforsmallRNA、Re-al-timePCR扩增试剂盒购自日本TaKaRa公司;miR-106a特异性逆转录引物、RNU6B引物均购自广州锐博生物科技有限公司;兔抗人Mcl-1多克隆抗体、兔抗人MMP2多克隆抗体均购自美国CST公司。
1.2方法
1.2.1qRT-PCR按RNAisoforsmallRNA说明书提取PC组织及对应癌旁组织中的smallRNA，采用miR-106a特异性引物，按以下条件进行反转录:70℃5min，37℃1h，85℃5min。以2μlcDNA为模板构建Real-timePCR反应体系，按如下条件进行PCR反应:95℃30s，95℃5s，60℃30s，扩增40个循环。以RNU6B基因为内参，采用2-△△Ct法计算miR-106a相对表达量。每个样本独立重复实验3次。1.2.2免疫组织化学染色组织标本常规脱水、石蜡包埋，切片制作4μm。切片经脱蜡、水化及抗原修复后;3%H2O2溶液阻断内源性过氧化物酶活性，10%山羊血清封闭;分别滴加兔抗人Mcl-1抗体(1∶100)、兔抗人MMP2多克隆抗体(1∶100)，4℃孵育过夜;洗涤后，加生物素标记的山羊抗兔二抗，37℃孵育30min;洗涤后滴加辣根过氧化物酶-链酶卵白素复合物进行反应，DAB显色、苏木素复染，常规脱水、透明、中性树胶封片。每张切片经由2位高年资病理医师，在高倍镜(×400)下随机选取10个视野，按文献所述标准［8］单独阅片、评分。最终评分≥1分者为阳性。1.2.3细胞培养人前列腺癌LNCap细胞株培养于含10%FBS的1×DMEM培养基中，置于37℃、5%CO2、饱和湿度下进行培养。每2～4日传代一次，稳定传代2～3代后，取对数生长期细胞进行实验。
1.3细胞转染
LNCap细胞接种于6孔板中，用含10%FBS的1×DMEM培养基培养细胞至融合度达50%左右，实验分组及处理如下:实验组每孔加入100pmolmiR-106amimics及5μl转染试剂;对照组每孔加入100pmol阴性对照(NegativeControl，NC)mimics及5μl转染试剂。每孔加入不含血清的1×DMEM培养基调整终体积至2ml，置于37℃、5%CO2、饱和湿度下培养6h后，更换完全培养基继续培养。独立重复实验3次。
1.4Westernblot
取转染72h后的LNCap细胞，加入RIPA细胞裂解液置冰上裂解10min，裂解液收集于1.5mlEP管中，4℃、14000r/min离心10min后取上清。BCA法测定总蛋白浓度，每孔加入50μg蛋白样品，10%SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白。采用Bio-Rad半干转印系统，20V转膜1h，5%BSA室温封闭1.5h后加入1∶1000稀释的Mcl-1一抗、MMP2一抗及β-actin一抗，4℃摇晃孵育过夜，0.01mol/LTBST漂洗5min×3次后加入1∶5000稀释的羊抗兔二抗，37℃孵育1h。0.01mol/LTBST漂洗5min×3次。于暗室内，在膜上滴加ECL溶液，并使胶片曝光，全自动洗片机洗片。每样本独立重复实验3次。
2结果
2.1前列腺癌组织及对应癌旁组织中miR-106a的相对表达量
我们对43例前列腺癌及对应癌旁组织中miR-106a表达量进行qRT-PCR检测，结果如图1所示，前列腺癌组织中miR-106a的相对表达量为(2.036±0.113)，显著低于对应癌旁组织(7.539±0.305)的表达水平，student-t检验证明二者差异具有统计学意义(P＜0.001)，提示miR-106a在前列腺癌组织中表达下调。
2.2前列腺癌组织中miR-106a的临床病理意义
为进一步研究miR-106a的临床病理意义，以miR-106a在肿瘤组织中的平均表达量(2.036±0.113)作为分界点，将43例前列腺癌组织分为miR-106a高表达组(n=19，44.19%)与miR-106a低表达组(n=24，55.81%)。收集整理43例前列腺癌患者年龄、是否患BPH、血清总PSA水平、有无淋巴结转移、病理分级及TNM分期等临床病理资料间的相关性进行分析结果发现，miR-106a低表达与高TNM分期(Ⅲ+Ⅳ)均显著相关(表1，P＜0.05)。经student-t检验，PC组织中miR-106a低表达与肿瘤淋巴结转移和高TNM分期(Ⅲ+Ⅳ)间具有显著相关性(P＜0.05)。
2.3前列腺癌组织中miR-106a与Mcl-1、MMP2的表达相关性分析
通过在TargetScan、microRNA.org等数据库中进行生物信息学检索发现，Mcl-1及MMP2可能为miR-106a的下游潜在靶点(图2A)。为研究其二者与前列腺癌组织中miR-106a表达间的相关性，我们对miR-106a低表达组及miR-106a高表达组的前列腺癌组织进中Mcl-1及MMP2的表达进行免疫组化染色，并对统计结果进行相关性分析。免疫组化结果显示，miR-106a低表达组肿瘤组织中Mcl-1和MMP2蛋白表达量均高于miR-106a高表达组(图2B)。如图2C所示，经Spearman相关分析证实，前列腺癌组织中miR-106a与Mcl-1和MMP2在表达上呈负相关关系，相关系数分别为r=－0.561(P=0.017)及r=－0.673(P=0.013)。
2.4过表达miR-106a对前列腺癌LNCap细胞中Mcl-1及MMP2表达的影响
与对照组相比，向LN-Cap细胞内转染入miR-106amimics后可将LNCap细胞内miR-106a的表达量升高约(3.274±0.152)倍(图3A，P＜0.05)。qRT-PCR及Westernblot检测发现，与对照组相比，过表达miR-106a显著下调了LNCap细胞内Mcl-1(1.000vs0.327±0.021)及MMP2(1.000vs0.269±0.018)mRNA(图3B)和蛋白(图3C)的表达水平(P＜0.05)。
3讨论
前列腺癌分子生物学诊断及生物靶向治疗的研究可以为提高前列腺癌早期诊治水平提供有力的理论依据。MicroRNA作为一种内源性多靶点短链RNA，能够同时对多个癌基因或抑癌基因产生调控作用，对于肿瘤生物靶向治疗具有重要应用价值。Mcl-1(Myeloidcellleukemia-1)是一种重要的抗细胞凋亡基因［13］，前列腺癌组织中常高表达Mcl-1蛋白，并与肿瘤快速生长和患者术后短期复发相关，miR-29b可以通过下调前列腺癌细胞中Mcl-1的表达来发挥抗肿瘤效应［14］。最新研究证实，肿瘤组织中过表达的Mcl-1还能够促进肿瘤细胞上皮-间质化转变(Epithelial-mesenchymaltransition，EMT)［15］，肿瘤EMT效应所导致肿瘤细胞上皮标志物E-cadherin表达减少，间质标志物Vimentin的表达增加是肿瘤发生淋巴结转移的主要分子基础［16］。基质金属蛋白酶2(Matrixmetalloproteinase2，MMP2)可降解Ⅳ型胶原蛋白，破坏细胞外基质对肿瘤细胞迁移和侵袭的限制作用，最终促进了肿瘤的淋巴结与远处转移［17］。本课题通过研究证实，miR-106a在前列腺癌组织中的表达水平显著低于对应癌旁组织，并且其低表达状态与肿瘤淋巴结转移及高TNM分期等恶性临床病理特征密切相关，提示miR-106a对于前列腺癌发生发展中具有重要的调控作用。通过对microRNA下游靶点预测数据库TargetScan和miran-da的生物信息学检索发现，Mcl-1及MMP2可能为miR-106a的下游潜在靶点。为在前列腺癌中证实miR-106a能否对Mcl-1及MMP2发挥负性调控作用，我们首先在组织学水平检测了不同miR-106a水平下前列腺癌组织中Mcl-1及MMP2的表达情况，并进行相关性分析。结果证实，miR-106a与Mcl-1及MMP2的表达间成显著负相关关系。为排除肿瘤中间质细胞及炎症细胞对实验结果的影响，我们通过体外培养前列腺LNCap细胞并在其中成功过表达miR-106a后，通过qRT-PCR及Westernblot检测证实，miR-106a的确能够显著下调前列腺癌细胞中Mcl-1及MMP2的mRNA和蛋白表达水平。提示在前列腺癌组织中miR-106a能够通过特异性降解癌基因Mcl-1及MMP2的表达来发挥抗肿瘤作用。综上所述，miR-106a在前列腺癌组织表达显著下调，低表达miR-106a与前列腺癌恶性临床病理特征密切相关。miR-106a可能通过下调耐药相关基因MMP2及Mcl-1的表达水平来调控前列腺癌的耐药表型。
作者：李金虎 赵晓俊 张江磊 魏雪栋 侯建全 单位：苏州大学附属第一医院泌尿外科
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