黄芩（Ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉａｂａｉｃａｌｅｎｓｉｓ）属唇形科黄芩属多年生草本植物，以根入药，为４０种大宗药材品种之一，其临床应用已有２０００余年历史，现在仍是清热燥湿、泻火解毒和止血安胎的要药。除中医配方外，黄芩还大量用作中成药原料。据《全国中成药产品目录》（第一部）统计显示，６６种蜜丸中４５种用黄芩，６４种片剂有４６种涉及黄芩，而３６种水丸则有２５种用黄芩，可见７０％中成药都含有黄芩，是制药工业的重要原料。黄芩植物约３００多种，世界广布，我国有１０１种，可作药用者仅９种，其中黄芩为药典收录的正品，粘毛黄芩（Ｓ．ｖｉｓｃｉｄｕｌａ）、甘肃黄芩（Ｓ．ｒｅｈｄｅｒｉａｎａ）、滇黄芩（Ｓ．ａｍｏｅｎａ）等则为逐步兴起的重要地方种［１］。黄芩以根入药，主要活性成分为黄酮类化合物，其中以黄芩苷为质量控制标准和有效物质基础。现代医学研究发现，黄芩苷具有广泛的药理作用，包括抗氧化、抗肿瘤、消炎抑菌、免疫调控、降压清脂、利尿利胆和保护心脑血管等，特别是配合其它中西疗法可有效防治癌症、艾滋病、糖尿病和冠心病，以及减轻组织缺血和修复皮肤病理性损伤，因此黄芩苷作为一种源于传统中药的天然产物，正受到越来越多的学术关注和市场青睐，其开发前景十分广阔［２－４］。由于黄芩苷的药效价值被日益重视，临床上对黄芩药材的需求量大增，导致其野生资源遭到严重破坏，黄芩已被列为国家三级濒危保护物种。虽然黄芩的人工种植技术已经基本成熟并获得推广应用，但生产周期较长、农药残留量较大、有效成分含量不高，因此该方式的商业前景并不明朗［５－６］。目前，国内外对黄芩的研究主要是人工栽培、生药鉴别、成分分离和组织培养等，对黄芩苷的研究则多集中于制备工艺、测定方法、生化特性和药理作用等，而对其生物合成的分子机理与代谢调控研究也日益受到人们的重视，并取得了一定进展［７］。近年来，利用现代生物技术手段改良和培育新型的黄芩苷药源已经引起学术界高度关注。然而，传统的细胞工程技术，包括组培快繁、悬浮细胞培养和毛状根培养，虽成功建立且在一定程度上促进了黄芩苷的合成和积累，但其含量增幅尚不稳定，因此定向优化植物重要性状的基因工程策略成为增加黄芩苷产量的理想途径之一［８－９］。特别是黄芩离体培养和遗传转化的成功以及黄芩苷生物合成途径的阐明，为利用基因工程技术遗传改良黄芩种质奠定了良好的实践基础［１０－１１］；同时黄芩苷代谢相关关键酶基因的生化功能获得鉴定，其分子调控体系也相继建立［１２－１３］，因此代谢工程技术是将来生产黄芩苷药源的理想途径。黄芩苷前体生物合成途径的分子遗传学和生物化学研究是开展黄芩苷代谢工程的必要前提。黄酮类化合物的合成途径可能是目前所了解的最清楚的植物次生代谢通路，目前已知的黄酮类化合物有上千种，但其生物合成途径十分保守，并且其中大部分代谢酶的基因及其功能已经获得克隆和验证，如拟南芥（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ）、矮牵牛（Ｐｅｔｕｎｉａｈｙｂｒｉｄａ）、大豆（Ｇｌｙｃｉｎｅｍａｘ）和苜蓿（Ｍｅｄｉｃａｇｏｓａｔｉｖａ）等。
１苯丙氨酸解氨酶
苯丙氨酸解氨酶（Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅａｍｍｏｎｉａ－ｌｙａｓｅ，ＰＡＬ）是苯丙烷途径的第一个关键酶。ＰＡＬ普遍存在于植物和某些真菌、细菌和藻类中，其功能是催化Ｌ－苯丙氨酸非氧化性脱氨生成反式肉桂酸（ｃｉｎｎａｍｉｃａｃｉｄ，ＣＡ），而肉桂酸是苯丙烷类次生物质（如黄酮、香豆素、木质素及某些酚类）生物合成的通用前体，因此该酶在植物次生代谢中具有极其重要的位置［１４］。多数被子植物中，ＰＡＬ是一个多基因家族，在一组染色体中含有一到多个ＰＡＬ基因。ＰＡＬ亚基通常由小型基因家族编码（一般２～５个成员），这些基因家族又图１黄芩苷生物合成途径Ｆｉｇ．１Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃｐａｔｈｗａｙｏｆｂａｉｃａｌｉｎ１８６可分成２或３个亚族，随植物不同而异。烟草（Ｎｉｃｏｔｉ－ａｎａｔａｂａｃｕｍＬ．）ＰＡＬ由２～４个独立基因编码，而欧芹（Ｐｅｔｒｏｓｅｌｉｎｕｍｃｒｉｓｐｕｍ）ＰＡＬ至少包含４个编码基因［１５］，例外的是火炬松，仅有１个ｐａｌ基因。Ｗｈｅｔｔｅｎ等［１６］采用多克隆抗体识别火炬松ＰＡＬ亚基，获得ｃＤＮＡ，经ＰＣＲ扩增后测定ｐａｌ基因序列，发现其与水稻、豆、甘薯等被子植物的编码序列存在６０％～６２％同源性。欧芹中ｐａｌ基因含有６个内含子，其上游含有一段富含ＣＴ的区段［１７］。目前已在诸如马铃薯（ＳｏｌａｎｕｍｔｕｂｅｒｏｓｕｍＬ．）、拟南芥、烟草、黄瓜（ＣｕｃｕｍｉｓｓａｔｉｖｕｓＬｉｎｎ．）和大麦（ＨｏｒｄｅｕｍｖｕｌｇａｒｅＬｉｎｎ．）等植物中，克隆到了编码ＰＡＬ酶的ｃＤＮＡ片段或基因组序列，其它多种植物的ｐａｌ基因已测序并在ＧｅｎＢａｎｋ注册［１８］。课题组也已分离获得粘毛黄芩的ｐａｌ编码基因，并进行了相应的序列和表达分析，发现黄芩ｐａｌ基因与其它植物ｐａｌ基因具有很高的同源性，从而证实了该基因具有高度的遗传保守性［９］。
２查尔酮合成酶
包括黄芩苷在内的所有黄酮类化合物的直接通用前体物均是柚皮苷查尔酮，它是由１分子桂皮酰辅酶Ａ与３分子丙二酸单酰辅酶Ａ缩合而成，其中前者来自苯丙酸中间途径，后者经醋酸经乙酰辅酶Ａ羧化酶催化生成。这个重要的缩合反应就是由查尔酮合成酶（Ｃｈａｌ－ｃｏｎｅｓｙｎｔｈａｓｅ，ＣＨＳ）催化完成的，这是黄酮类化合物合成中第１个关键酶，具有限速作用［１９］。自从第１个荷兰芹的ｃｈｓ基因在１９８３年发布以来［２０］，迄今已从多种植物中克隆了ｃｈｓ基因，如高粱（Ｓｏｒｇｈｕｍｂｉｃｏｌｏｒ）［２１］、兰花（ＯｒｃｈｉｄＢｒｏｍｈｅａｄｉａｆｉｎｌａｙ－ｓｏｎｉａｎａ）［２２］和拟南芥［２３］等。ｃｈｓ基因在不同植物类群中保守性较高，一般都含有２个外显子和１个内含子，而金鱼草ｃｈｓ则含有２个内含子［２４］。ｃｈｓ基因的外显子１和２分别编码６０个和３４０个左右氨基酸残基，但在序列长度和核苷酸组成方面外显子２的保守性高于外显子１，而作为活性位点的４个保守氨基酸残基位于外显子２中。ｃｈｓ基因内含子的大小及序列差异都较大。不同物种中查尔酮合酶在氨基酸水平上的一致性很高，约７９％～９１％，说明其具有高度的遗传保守性［２５］。ｃｈｓ基因启动子具有多个对环境感受的特异性元件，如接受激发子诱导的ＡＣＥ元件（ＡＣＧＴｅｌｅ－ｍｅｎｔ）［２６－２７］和Ｈ区（Ｈ－ｂｏｘ）［２８］，富含ＡＴ元件区［２９－３０］、以及负调控的沉默子［３１］和维持基因转录水平的Ｐ区［３２］。大部分植物的ＣＨＳ编码基因是一个多基因家族，如矮牵牛、大豆和豌豆等，特别是双子叶植物的ｃｈｓ家族基因数目较多，如菜豆中已发现８个ｃｈｓ基因［３３］，矮牵牛的ｃｈｓ基因家族包括８～１０个成员［３４］。虽然ｃｈｓ基因家族中数目较多，但各成员基因编码区的同源性较高。由于ＣＨＳ在植物外源基因的表达、细胞的发育和分化、花色素的积累和抗菌、抗胁迫生理过程等起着重要的作用，因此ｃｈｓ基因家族的不同成员往往受植物不同发育时期和组织特异性调控，对不同外源刺激的敏感程度也不同，这个特点与黄酮类物质的功能多样性相适应［３５］。该课题组基于黄芩ｃｈｓ家族，利用同源性克隆方法，克隆获得了粘毛黄芩ｃｈｓ基因，并从分子水平上验证了所选植物的ｃｈｓ可能起源于同一个祖先，也反映出黄酮化合物为聚类指标的进化生物学意义，从而说明作为类黄酮代谢关键酶的ＣＨＳ蛋白在自然演化进程中的遗传保守性和功能稳定性［３６－３７］。ｃｈｓ基因具有显著的时空差异性表达模式，如组织和发育时期的特异性表达，在一些植物发育的早期阶段ＣＨＳ在叶片中表达，而成熟植株中主要仅限于花组织中存在；ｃｈｓ基因接受诱导因子调控的特异性转录，在很多植物（如矮牵牛、菜豆等）中，外界刺激如胁迫、紫外线和病原体会诱导ＣＨＳ的快速响应并表达，ＣＨＳ的这种对外界刺激的敏感程度的差异特点与ＣＨＳ编码序列上游启动子中含有的特异性顺式作用元件有关［３８］。此外，笔者也发现粘毛黄芩ｃｈｓ基因受到外源甲基茉莉酸的时间依赖性地调控，并建立了其诱导差异表达谱［３７］。在基因工程领域，对ｃｈｓ基因调控作用的研究主要集中于植物花色表型和抗逆性状的遗传改良，而这种改变实质上也是基于细胞和组织内黄酮化合物的含量调节，例如通过对ｃｈｓ基因的反义或共抑制操作培育颜色变异的转基因花卉［３９］，也可以正调节马铃薯中的ｃｈｓ基因增加花色素苷等黄酮类化合物的积累，从而改善其抗氧化能力［４０］，而基于烟草转化系统的研究证实黄芩ｃｈｓ基因在驱动黄酮化合物生物合成的过程中发挥了重要作用［４１］。
３黄烷酮３－羟化酶
黄烷酮３－羟化酶（ｆｌａｖａｎｏｎｅ３－ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ，Ｆ３Ｈ）是黄烷酮分支点的一个核心酶，其作用是催化５，７，４－黄烷酮Ｃ３位的羟化，生成二氢山奈素（ｄｉｈｙｄｒｏｋａｅｍｐｆｅｒｏｌ，ＤＨＫ），而该物质则是合成黄烷酮和花色素的重要中间产物［４２］。因此Ｆ３Ｈ也是黄酮化合物生物合成途径中的关键酶，是控制黄酮合成与花青素苷积累的分流节点，被认为是整个类黄酮代谢途径的中枢。１９９１年，人们首次获得ｆ３ｈ基因序列，是从金鱼草中克隆出来［４３］。目前已经在拟南芥［４４］、苜蓿［４５］和玉米（Ｚｅａｍａｙｓ）［４６］中被陆续分离鉴定，且是以单拷贝形式存在，但在甘蓝型油菜和紫苏中则是以多基因家族形式存在，分别含有５～７个和２～３个成员。在这些植物中，ｆ３ｈ基因一般具有３个外显子和２个内含子［４５］。笔者首次克隆了粘毛黄芩的ｆ３ｈ基因，通过系统进化树分析，从分子水平上验证了所选植物的ｆ３ｈ可能起源于同一个祖先，也反映出植物间的植物黄酮醇类化合物的含量与植物间亲缘关系有一定关系。ｆ３ｈ基因在一些植物中是独立表达的，如矮牵牛中的ｆ３ｈ基因，而在大多数的情况下，ｆ３ｈ则是和其上游的ｃｈｓ、ｃｈｉ（查尔酮异构酶）基因以及下游的ｄｆｒ（二氢黄酮醇还原酶）基因协同表达的，这在拟南芥和金鱼草中都有相关的报道。此外，矮牵牛和金鱼草中ｆ３ｈ基因突变失活则可在阻断花色素的合成通路，获得白花的矮牵牛或金鱼草［４３，４７］。近期研究表明，通过调控ｆ３ｈ基因的表达能够有效改变植物花卉或种皮的颜色，基于该基因的遗传操作已成为花卉育种研究的重要手段［４４，４８］；而旨在高产黄酮和异黄酮的药物代谢工程领域，通过反义抑制ｆ３ｈ基因阻断花青素合成途径能够使通用前体柚皮苷更多地流向黄酮和异黄酮，从而获得促进目标产物的积累，该方式证明Ｆ３Ｈ是黄酮代谢工程的重要靶点［４９］。由此可见，ｆ３ｈ是黄酮生物合成途径上关键的限速基因，其催化反应是黄酮合成调控的的重要步骤。
４小结
黄芩是中国传统的大宗药材，含有许多对人类健康有益的活性成分和疾病治疗的药用物质，而最重要的则是包括黄芩苷在内的黄酮类化合物。因此在分子生物学水平上开展黄芩苷生物合成途径和代谢工程技术的研究具有十分重要的意义。文章结合笔者及其课题组在黄芩次生代谢与分子遗传学领域的长期工作积累，阐述了黄芩苷生物合成与基因调控的研究进展，旨在为以高产黄芩苷等黄酮类有效成分的新型优质黄芩种质创新提供参考依据。
作者：雷桅单位：广东医学院心血管疾病研究室
