1数据分析
用SPSS17．0软件对所提取DNA得率进行单因素方差分析。1．5PCR扩增及检测本实验选取引物Cytb－1(5＇－CCATCCAACATCT-CAGCATGATGAAA－3＇)和Cytb－2(5＇－CCCTCAGAAT-GATATTTGTCCTCA－3＇)，扩增片段长约350bp［11］。引物COI－1(5＇－CACAAAGACATTGGCACCCT－3＇)和COI－2(5＇－CCTCCTGCAGGGTCAAGAA－3＇)，扩增片段长约650bp［12］，由上海生工生物公司合成。COI－1/COI－2引物扩增条件:95℃预变性5min;94℃变性1min，52℃退火1min，72℃延伸1min，30个循环;72℃延伸5min。Cytb－1/Cytb－2引物扩增条件:95℃预变性5min;94℃变性1min，50℃退火1min，72℃延伸1min，30个循环;72℃延伸5min。PCR产物用1．5%琼脂糖凝胶检测。
2分析
2．19种DNA提取方法所得DNA得率比较
9种DNA提取方法对3种水产加工品DNA提取得率如图1所示。经SPSS17．0方差分析可知，9种提取方法对于3种水产加工品所提取DNA得率相差较大，样品和提取方法均对DNA得率具有极显著性影响。由图1可以看出，对于冻鱼块样品，采用试剂盒1提取DNA，得率为1．223μg/mg;采用试剂盒3提取DNA，得率为1．190μg/mg;采用SDS法，得率为1．057μg/mg。以试剂盒1提取DNA得率最高。对于烤鱼片样品，采用SDS法，DNA得率为0．505μg/mg;采用改良CTAB法，DNA得率为0．480μg/mg，以SDS法提取DNA得率最高。对于鱼罐头样品，采用SDS法提取DNA，得率为0．594μg/mg;采用酚/氯仿法提取DNA，得率为0．419μg/mg，以SDS法提取DNA得率最高。
2．29种DNA提取方法所得DNA纯度比较
参照Chapela［9］的方法，对9种DNA提取方法提取3种水产加工品DNA的A260/A280值进行比较，如图2所示。DNA的A260/A280比值在2．0左右认为纯度较好［9］，由图2可以看出，对于冻鱼块样品，除试剂盒2、试剂盒5外，其它方法所提取DNA的A260/A280值均在2．0左右;对于烤鱼片样品，除试剂盒2、试剂盒4、试剂盒5外，其它方法所提取DNA的A260/A280值均在2．0左右;对于鱼罐头样品，除试剂盒2、试剂盒5外，其它方法所提取DNA的A260/A280值均在2.0左右。
2．3提取DNA的PCR检测
以所提取DNA为模板，利用COI－1/COI－2为引物进行PCR扩增，以分析所提DNA能否满足PCR的要求，电泳图如图3、图4和图5所示。由图3、图4和图5可以看出，对于冻鱼块样品，9种方法提取的DNA，均可利用引物COI－1/COI－2扩增出约650bp的片段，与目的片段大小一致。对于烤鱼片和鱼罐头样品，以COI－1/COI－2为引物进行PCR扩增，电泳未见目的片段。原因可能为冻鱼块样品加工方式较简单，DNA降解、损伤程度较弱，所提取DNA能够满足PCR扩增要求;而烤鱼片和鱼罐头样品在加工过程中受到高温高压等条件的作用，DNA断裂和降解严重，所提取DNA难以满足较大片段的扩增。鉴于以上结果，采用引物Cytb－1/Cytb－2对所提取DNA模板进行扩增。结果如图6、图7和图8所示。由图6、图7和图8可以看出，从3种样品中所提取DNA用Cytb－1/Cytb－2引物均可以扩增出大小约为350bp的目的片段，证明几种提取方法所提取的DNA可以满足分子鉴定实验的要求。
2．4样品原料真伪鉴别
对以上样品利用引物Cytb－1/Cytb－2扩增其Cytb部分序列，引物扩增的PCR产物送至上海生工生物公司测序。将测序结果与GenBank中参考序列比对，比对结果表明:冻鱼块样本的测序结果与大西洋鳕(Gadusmorhua)(EU877737．1)的相似度为99%，烤鱼片样本与怀氏兔头鲀(Lagocephaluswheeleri)(FJ823445．1)相似度为99%，鱼罐头样本与鲣(Katsuwonuspelamis)(JQ434035．1)相似度为99%。以原鸡Gallusgallus(HQ285909．1)为外类群，采用Mega3．0软件［13］将样品与GenBank中参考序列进行系统发生分析，N－J法建树，结果如图9所示。由图9可以看出，分析结果与BLAST比对结果相似，烤鱼片样品与怀氏兔头鲀聚为一树，表明烤鱼片原材料与怀氏兔头鲀亲缘关系较近。本样品商品名为烤马面鱼，提示本商品可能存在标识不准确的现象;鱼罐头样品与鲣聚为一树，表明鱼罐头原材料与鲣亲缘关系较近。本样品商品名为金枪鱼罐头，而广义上的金枪鱼包含鲣，说明该商品标识正确;冻鱼块样品与大西洋鳕聚为一树后与其它两树相聚，表明冻鱼块原材料与大西洋鳕亲缘关系较近。本样品商品名为冻鳕鱼块，说明该商品标识正确;原鸡作为外类群自成一树。
3讨论与结论
DNA的提取是利用分子生物学方法鉴定水产品原料真伪的第一步，也是关键的一步，提取DNA质量直接关系后续实验的成功与否，尤其是罐头等深加工水产品，由于高温、高压、水解等理化因素的影响，难以获得高质量DNA［14－15］。本研究中CTAB法在4种人工提取DNA方法中得率最低，这与CTAB法被认为是一种提取水产加工品DNA标准方法［16］的观点不相符合。有研究者认为不同种类水产品以及不同CTAB浓度会对提取效率产生影响［17］，CTAB的浓度不合适时，DNA会与脂肪形成复合物［18］，并且当CTAB与DNA比例大于1.0时，两者结合成不溶性固体［19］，从而影响DNA得率。因此可以针对每一种水产品分别研究合适浓度的CTAB法以获得最佳提取效果。酚/氯仿法和SDS法均能获得较高DNA得率，且SDS法在原方法的基础上加入一定量蛋白酶K后，DNA得率及纯度都有较大提高，与CTAB法相比，通用性更好，适于对大多数水产加工品进行DNA提取。冻鱼块样品DNA提取得率总体高于烤鱼片和鱼罐头样品，原因可能为烤鱼片和鱼罐头样品经过若干道加工程序，理化性质发生很大变化，并且罐头、烤鱼片等水产加工品常含有阳离子(如Ca2+，Fe2+)、微量重金属、碳水化合物、单宁酸、酚类、盐分和亚硝酸盐等物质，可能会影响试剂反应及蛋白酶消化效果［20］，这在很大程度上增加了DNA提取的难度，从而影响DNA得率。通过实验发现，CTAB法、改良CTAB法、酚－氯仿法和SDS法这4个经典的提取方法无需昂贵仪器和试剂，只需水浴锅、离心机和通风橱等基本仪器设备，提取的DNA能够满足一般分子生物学的需要，可以作为DNA提取的常规方法。但上述方法操作步骤繁琐，耗时长，易交叉污染，在DNA溶液中可能残留有机试剂，对PCR反应产生抑制作用，酚、氯仿等有机溶剂易造成环境污染，有损实验人员的身体健康。采用试剂盒法提取DNA，无需酚/氯仿抽提，使用安全快捷方便，但价格较高，DNA得率较低。具体提取方法可根据实验室的条件进行选择。对于水产加工品DNA提取，国外一些研究机构还基于硅胶吸附法［21－24］和磁珠法［25－29］进行了自动化、高通量DNA提取方法的研究。Richardson等报道了一种高通量DNA提取技术，将磁珠技术与液压自动化装置结合，可满足每周进行800个样品的鉴定要求［29］，这对加工水产品DNA的自动化、高通量提取提供了可借鉴的思路，同时为水产品真伪鉴定的高效和自动化奠定了基础。本实验通过对9种DNA提取方法的比较，改进并筛选出了分别适用于不同水产加工品的DNA提取方法，为后续水产加工品原料真伪鉴别研究提供了可靠的依据。
作者：姚琳 李青娇 江艳华 姜薇 李风铃 王联珠 翟毓秀 单位：中国水产科学研究院黄海水产研究所 农业部水产品质量安全检测与评价重点实验室 南京农业大学渔业学院
